Генная инженерия позволяет получить все кроме. Генная инженерия

Генная инженерия (генетическая инженерия) – совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы .

Генная инженерия – составная часть современной биотехнологии, теоретической основой ее является молекулярная биология, генетика. Суть новой технологии заключается в направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма (in vitro) с последующим внедрением созданных конструкций в живой организм. В результате достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства. Возможности генной инженерии – генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение генно-инженерно-модифицированных (генетически модифицированных, трансгенных) организмов с новыми уникальными генетическими, биохимическими и физиологическими свойствами и признаками, делают это направление стратегическим.

С точки зрения методологии генная инженерия сочетает в себе фундаментальные принципы (генетика, клеточная теория, молекулярная биология, системная биология), достижения самых современных постгеномных наук: геномики, метаболомики, протеомики с реальными достижениями в прикладных направлениях: биомедицина, агробиотехнология, биоэнергетика, биофармакология, биоиндустрия и т.д.

Генная инженерия относится (наряду с биотехнологией, генетикой, молекулярной биологией, и рядом других наук о жизни) к сфере естественных наук.

Историческая справка

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. В 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК, на рубеже 50 – 60-х годов 20 века были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E.coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 1970 году Г.Смитом был впервые выделен ряд ферментов – рестриктаз, пригодных для генно-инженерных целей. Г.Смит установил, что полученный из бактерий очищенный фермент HindII сохраняет способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот (нуклеазная активность), характерную для живых бактерий. Комбинирование ДНК-рестриктаз (для разрезания молекул ДНК на определенные фрагменты) и выделенных еще в 1967 г. ферментов – ДНК-лигаз (для «сшивания» фрагментов в произвольной последовательности) по праву можно считать центральным звеном в технологии генной инженерии.

Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии

Академик А.А. Баев был первым в нашей стране ученым, который поверил в перспективность генной инженерии и возглавил исследования в этой области. Генетическая инженерия (по его определению) – конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе – создание искусственных генетических программ.

Задачи и методы генной инженерии

Хорошо известно, что традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, которые препятствуют получению новых пород животных, сортов растений или рас практически ценных микроорганизмов:

1. отсутствие рекомбинации у неродственных видов. Между видами существуют жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию.
2. невозможность управлять процессом рекомбинации в организме извне. Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к неспособности сближаться и обмениваться отдельными участками (и генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос нужных генов и обеспечение оптимального сочетания в новом организме генов, полученных от разных родительских форм;
3. невозможность точно задать признаки и свойства потомства, т.к. процесс рекомбинации – статистический.

Природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности генома организма, практически невозможно преодолеть методами классической селекции.

Технология получения генетически модифицированных организмов (ГМО) принципиально решает вопросы преодоления всех естественных и межвидовых рекомбинационных и репродуктивных барьеров. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Генная инженерия позволяет оперировать любыми генами, даже синтезированными искусственно или принадлежащими не родственным организмам, переносить их от одного вида к другому, комбинировать в произвольном порядке.

Технология включает несколько этапов создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для встраивания в организм.
3. Перенос вектора с конструкцией в модифицируемый организм-рецепиент.
4. Молекулярное клонирование.
5. Отбор ГМО.

Первый этап – синтез, выделение и идентификация целевых фрагментов ДНК или РНК и регуляторных элементов очень хорошо разработан и автоматизирован. Изолированный ген может быть также получен из фаговой библиотеки.

Второй этап – создание in vitro (в пробирке) генетической конструкции (трансгена), которая содержит один или несколько фрагментов ДНК (кодирующих последовательность аминокислот белков) в совокупности с регуляторными элементами (последние обеспечивают активность трансгенов в организме). Далее трансгены встраивают в ДНК вектора для клонирования, используя инструментарий генной инженерии – рестриктазы и лигазы. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии (1978 г.). Как правило, в качестве вектора используют плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК бактериального происхождения.

Следующий этап – собственно «генетическая модификация» (трансформация), т.е. перенос конструкции «вектор – встроенная ДНК» в отдельные живые клетки. Введение готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных представляет собой сложную задачу, которая была решена после изучения особенностей внедрения чужеродной ДНК (вируса или бактерии) в генетический аппарат клетки. Процесс трансфекции был использован как принцип введения генетического материала в клетку.

Если трансформация прошла успешно, то после эффективной репликации из одной трансформированной клетки возникает множество дочерних клеток, содержащих искусственно созданную генетическую конструкцию. Основой для появления у организма нового признака служит биосинтез новых для организма белков – продуктов трансгена, например, растений – устойчивости к засухе или насекомым-вредителям у ГМ растений.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации ограничивается встраиванием рекомбинантной плазмиды с последующим отбором модифицированных потомков (клонов). Для высших многоклеточных организмов, например, растений, то обязательным является включение конструкции в ДНК хромосом или клеточных органелл (хлоропластов, митохондрий) с последующей регенерацией целого растения из отдельной изолированной клетки на питательных средах. В случае животных, клетки с измененным генотипом вводят в бластоциды суррогатной матери. Первые ГМ растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsanto.

Основные направления

Постгеномная эра в первой декаде XXI-ого века подняла на новый уровень развитие генной инженерии. Так называемый Кельнский Протокол «На пути к биоэкономике, основанной на знаниях» , определил биоэкономику как «преобразование знаний наук о жизни в новую, устойчивую, экологически эффективную и конкурентоспособную продукцию». Дорожная карта генной инженерии содержит целый ряд направлений: генотерапия, биоиндустрия, технологии, основанные на стволовых клетках животных, ГМ растения, ГМ животные и т.д.

Генетически модифицированные растения

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой «Calgen», а также гербицид-устойчивая соя компании «Monsanto». Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В РФ возможность получения трансгенного картофеля методом бактериальной трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens была показана в 1990 г.

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более 100 миллиардов долларов. Генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки.

В России под руководством академика К.Г. Скрябина (Центр «Биоинженерия» РАН) получены и охарактеризованы ГМ сорта картофеля Елизавета плюс и Луговской плюс, устойчивые к колорадскому жуку. По результатам проверки Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на основании экспертного заключения ГУ НИИ питания РАМН данные сорта прошли государственную регистрацию, внесены в государственный реестр и разрешены для ввоза, изготовления и оборота на территории РФ.

Данные ГМ сорта картофеля принципиально отличается от обычных наличием в его геноме встроенного гена, определяющего 100%-ю защиту урожая от колорадского жука без использования каких-либо химических средств.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название «метаболическая инженерия». При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие «лекарственные» белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Генетически модифицированные животные

Клетки животных существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК, поэтому методы и способы способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и рыб остаются в центре внимания генных инженеров.

Наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее – мыши. Первый успех относится к 1980 году, когда Д. Гордон с сотрудниками продемонстрировал возможность введения и интеграции чужеродной ДНК в геном мышей. Интеграция была стабильной и сохранялась у потомства. Трансформацию производят микроинъекцией клонированных генов в один или оба пронуклеуса (ядра) только что эмбриона на стадии одной клетки (зиготы). Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер – от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 – 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Таким методом получены генно-инженерные крысы, кролики, овцы, свиньи, козы, телята и другие млекопитающие. В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. ГМ свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке. С помощью животных-биореакторов (трансгенные коровы) уже получено молоко, в котором содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируется применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию.

Важное направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Ген интерферона, относящийся к защитным белкам, встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость – они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Применение в научных исследованиях

Нокаут гена (gene knockout) – техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать функции гена. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист суррогатной матери. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искусственная экспрессия – добавление в организм гена, которого у него ранее не было, также с целями изучения функции генов. Визуализация продуктов генов – используется для изучения локализации продукта гена. Замещение нормального гена на сконструрованный ген, слитый с репортёрным элементом, (например, с геном зелёного флуоресцентного белка) обеспечивает визуализацию продукта генной модификации.

Исследование механизма экспрессии. Небольшой участок ДНК, расположенный перед кодирующей областью (промотор) и служащий для связывания факторов транскрипции, вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP, катализирующий легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать экспрессию генов.

Биобезопасность генно-инженерной деятельности

Еще в 1975 г. ученые всего мира на Асиломарской конференции подняли важнейший вопрос: не окажет ли появление ГМО потенциально негативного воздействия на биологическое разнообразие? С этого момента одновременно с бурным развитием генной инженерии стало развиваться новое направление - биобезопасность. Главная ее задача - оценить не несет ли использование ГМО нежелательное воздействие на окружающую среду, здоровье человека и животных, а главная цель - открыть путь к использованию достижений современной биотехнологии, гарантируя при этом безопасность.

Стратегия биобезопасности основывается на научном исследовании особенностей ГМО, опыте обращения с ним, а также информации о его предполагаемом использовании и окружающей среде, в которую он будет интродуцирован. Совместными многолетними усилиями международных организаций (ЮНЕП, ВОЗ, ОЭСР), экспертов из разных стран, в т. ч. России, были разработаны базовые понятия и процедуры: биологическая безопасность, биологическая опасность, риск, оценка рисков. Только после того, как полный цикл проверок будет успешно осуществлен, готовится научное заключение о биобезопасности ГМО. В 2005 г. ВОЗ опубликовало доклад, согласно которому употребление зарегистрированных в качестве пищи ГМ растений также безопасно, как их традиционных аналогов.

Как обеспечивается биобезопасность в России? Началом включения России в мировую систему биобезопасности можно считать ратификацию «Конвенции о биоразнообразии» в 1995 году. С этого момента началось формирование национальной системы биобезопасности, отправной точкой которой явилось вступление в силу Федерального закона РФ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (1996 г.). ФЗ устанавливает основные понятия и принципы государственного регулирования и контроля всех видов работ с ГМО. ФЗ устанавливает уровни риска в зависимости от типа ГМО и вида работ, дает определения замкнутой и открытой систем, выпуска ГМО и т.д.

За прошедшие годы в России сформировалась одна из самых жестких систем регулирования. Неординарен тот факт, что система государственного регулирования ГМО стартовала превентивно, в 1996 году, до того, как реальные генно-инженерные организмы были заявлены для коммерциализации на территории России (первый ГМО – ГМ соя - была зарегистрирована для пищевого использования в 1999г.). Базовыми правовыми инструментами служат государственная регистрация генно-инженерно-модифицированных организмов, а также продукции, полученной из них или их содержащей, предназначенных для использования в качестве пищи и кормов.

Для понимания современной ситуации важен факт, что в течение 25 лет, прошедших с момента первого выхода ГМ растений на рынок, не было выявлено ни одного достоверного отрицательного воздействия их на окружающую среду и здоровье человека и животных ни в ходе испытаний, ни при коммерческом использовании. Только в одном из мировых источников – отчете авторитетного общества AGBIOS «Essential Biosafety» содержится более 1000 ссылок на исследования, доказывающие, что пища и корма, полученные из биотехнологических культур, настолько же безопасны, насколько безопасны и традиционные продукты. Однако на сегодняшний день в России отсутствует нормативно-правовая база, которая позволила бы осуществлять на территории нашей страны выпуск в окружающую среду ГМ растений, а также продукции, полученной из них или их содержащей. Как следствие – на 2010 год ни одно ГМ растение не выращивается на территории Российской Федерации в коммерческих целях.

По прогнозу, согласно Кельнскому Протоколу (2007 г), к 2030 г. отношение к сельскохозяйственным ГМ культурам изменится в сторону одобрения их использования.

Достижения и перспективы развития

Генная инженерия в медицине

Потребности здравоохранения, необходимость решения проблем старения населения формируют устойчивый спрос на генно-инженерные фармпрепараты (с годовым объемом продаж в 26 млрд. долл. США) и лечебно-косметические средства из растительного и животного сырья (с годовым объемом продаж около 40 млрд. долл. США).

Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное – получение человеческого инсулина в промышленных масштабах.

В настоящее время по данным ВОЗ в мире насчитывается около 110 млн. людей, страдающих диабетом. Инсулин, инъекции которого показаны больным этим заболеванием, уже давно получают из органов животных и используют в медицинской практике. Однако многолетнее применение животного инсулина ведет к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина. Но даже потребности в животном инсулине до недавнего времени удовлетворялись всего на 60 – 70%. Генные инженеры в качестве первой практической задачи клонировали ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. В России получение генно-инженерного человеческого инсулина – Инсурана ведется в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Сегодня отечественный инсулин производится в объеме, достаточном для обеспечения больных диабетом г. Москвы. Вместе с тем, потребность всего российского рынка в генно-инженерном инсулине удовлетворяется, в основном, импортными поставками. Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 2500 кг.

Развитие генной инженерии в 80-х годах прошлого столетия обеспечило хороший задел России в создании генно-инженерных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами – продуцентов биологически активных веществ, в разработке генно-инженерных методов реконструирования генетического материала вирусов, в получении лекарственных субстанций, в том числе и с использованием компьютерного моделирования. До стадии производства доведены рекомбинантный интерферон и лекарственные формы на его основе медицинского и ветеринарного назначения, интерлейкин (b-лейкин), эритропоэтин. Несмотря на растущий спрос на высокоочищенные препараты, отечественное производство иммуноглобулинов, альбумина, плазмола обеспечивает 20% потребностей внутреннего рынка.

Активно ведутся исследования по разработке вакцин для профилактики и лечения гепатитов, СПИДа и ряда других заболеваний, а также конъюгированных вакцин нового поколения против наиболее социально значимых инфекций. Полимер-субъединичные вакцины нового поколения состоят из высокоочищенных протективных антигенов различной природы и носителя – иммуностимулятора полиоксидония, обеспечивающего повышенный уровень специфического иммунного ответа. Прививки против подавляющего большинства известных инфекций Россия могла бы обеспечить на базе собственного иммунологического производства. Полностью отсутствует только производство вакцины против краснухи.

Генная инженерия для сельского хозяйства

Генетическое улучшение сельскохозяйственных культур и декоративных растений представляет собой длительный и непрерывный процесс с использованием все более точных и предсказуемых технологий. В научном отчете ООН (за 1989 год) сказано следующее: «Поскольку молекулярные методы наиболее точны, те, кто их применяет, в большей степени уверены в том, какими признаками они наделяют растения, и, следовательно, реже получают незапланированные эффекты, чем при использовании обычных методов селекции.»

Преимущества новых технологий уже широко используются в таких странах, как США, Аргентина, Индия, Китай и Бразилия, где генетически модифицированные культуры возделывают на больших территориях.

Новые технологии также имеют большое значение для малоимущих фермеров и жителей бедных стран, особенно женщин и детей. Например, генетически модифицированные, устойчивые к вредителям, хлопчатник и кукуруза требуют применения инсектицидов в значительно меньших объемах (что делает труд на ферме более безопасным). Такие культуры способствуют повышению урожайности, получению фермерами более высоких доходов, снижению уровня бедности и риска отравления населения химическими пестицидами, что особенно характерно для ряда стран, в том числе для Индии, Китая, ЮАР и Филиппин.

Самыми распространенными ГМ растениями являются культуры, устойчивые к недорогим, наименее токсичным и наиболее широко используемым гербицидам. Возделывание таких культур позволяет получать более высокий урожай с гектара, избавиться от изнурительной ручной прополки, тратить меньше средств за счет минимальной или беспахотной обработки земли, что, в свою очередь, приводит к снижению эрозии почвы.

В 2009 году произошла замена генетически модифицированных культур первого поколения продуктами второго поколения, что впервые привело к увеличению урожайности per se. Пример биотехнологической культуры нового класса (над созданием которой работали многие исследователи) – устойчивая к глифосату соя RReady2Yield™ , выращивалась в 2009 году в США и Канаде более чем на 0.5 миллионах га.

Внедрение генной инженерии в современную агробиологию может быть проиллюстрировано следующими фактами из ряда зарубежных экспертных обзоров, в том числе, из ежегодного обзора независимой Международной службы по мониторингу за применением агробиотехнологий (ISAАA), возглавляемой известным в мире экспертом Клайвом Джеймсом (Claiv James): (www.isaaa.org)

В 2009 году в 25 странах мира выращивали ГМ культуры на площади 134 млн. га (что составляет 9% от 1,5 млрд. га всех пахотных земель в мире). Шесть стран ЕС (из 27) возделывали Bt кукурузу, и в 2009 году площади ее посевов достигли более 94 750 га. Анализ мирового экономического эффекта использования биотехнологических культур за период с 1996 по 2008 г.г. показывает рост прибыли в размере 51,9 миллиардов долларов благодаря двум источникам: во-первых, это сокращение производственных затрат (50%) и, во-вторых, значительная прибавка урожая (50%) в размере 167 миллионов тонн.

В 2009 году общая рыночная стоимость семян ГМ культур в мире составила 10.5 миллиардов долларов. Общая стоимость по зерну биотех кукурузы и сои, а также хлопчатника в 2008 году составила 130 млрд. долларов, и ожидается, что ее ежегодный рост составит 10 – 15%.

Подсчитано, что в случае полного принятия биотехнологии, к концу периода 2006 – 2015 г. прибыль всех стран в пересчете на ВВП вырастет на 210 млрд. долл. США в год.

Наблюдения, проводимые с начала применения в сельском хозяйстве устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур, убедительно доказывают, что фермеры получили возможность более эффективно бороться с сорняками. При этом рыхление и распахивание полей утрачивают свое значение как средства борьбы с сорняками. В итоге снижается расход тракторного топлива, улучшается структура почвы и предотвращается ее эрозия. Целевые инсектицидные программы выращивания Bt хлопчатника предусматривают меньшее число опрыскиваний посевов и, следовательно, меньшее количество выездов техники на поля, что приводит к сокращению эрозии почв. Все это невольно содействует внедрению консервирующей технологии обработки почвы, направленной на снижение почвенной эрозии, уровня углекислого газа и уменьшения потери воды.

Для современного состояния науки характерен комплексный подход, создание единых технологических платформ для проведения широкого спектра исследований. Они объединяют не только биотехнологию, молекулярную биологию и генную инженерию, но также и химию, физику, биоинформатику, транскриптомику, протеомику, метаболомику.

Рекомендуемая литература
1. Дж. Уотсон. Молекулярная биология гена. М.: Мир. 1978.
2. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1981
3. С.Н. Щелкунов «Генетическая инженерия». Новосибирск, издательство Сибирского Университета, 2008
4. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002
5. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Под редакцией Дж. Дрейпера, Р.Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М.: «Мир». 1991.
6. Агробиотехнология в мире. Под ред. Скрябина К.Г. М.: Центр «Биоинженерия» РАН, 2008. – 135 с.
7. Кларк. Д., Рассел Л. Молекулярная биология простой и занимательный подход. М.: ЗАО «Компания КОНД». 2004

Ссылки
1. «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности». ФЗ-86 в ред. 2000 г., ст.1
2. Кельнский Протокол, Cologne Paper, принят на конференции «На пути к Биоэкономике, основанной на знаниях» (Кельн, 30 мая 2007 г.), организованной Европейским Союзом в период президентства Германии в ЕС.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (син. генетическая инженерия ) - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в т. ч. и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе Г. и. лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых к-т. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода (см.), т. е. факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируется одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получать в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой к-ты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых к-т, объединить в единое целое полученные фрагменты. Т. о., изменение наследственных свойств организма с помощью Г. и. сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введению этого материала в реципиентный организм, созданию условий для его функционирования и стабильного наследования.

Один из способов получения генов - хим. синтез. После того как Холли (A. Holli) в США, А. А. Баеву в СССР и другим исследователям удалось расшифровать структуру различных транспортных РБГК (тРНК), X. Корана с соавт, осуществил хим. синтез ДНК, кодирующей аланиновую тРНК пекарских дрожжей.

Но наиболее эффективный метод искусственного синтеза генов связан с использованием фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза), обнаруженного Балтимором (D. Baltimore) и Темином (H. Temin) в онкогенных вирусах (см.). Этот фермент выделен и очищен из клеток, зараженных некоторыми РНК-содержащими онкогенными вирусами, в т. ч. вирусом птичьего миелобластоза, саркомы Рауса, мышиной лейкемии. Обратная транскриптаза обеспечивает синтез ДНК на матрице информационной РНК (иРНК). Использование молекул иРНК как матриц для синтеза ДНК в значительной степени облегчает искусственный синтез отдельных структурных генов высших организмов, поскольку последовательность азотистых оснований в молекуле иРНК является точной копией последовательности азотистых оснований соответствующих структурных генов, а методика выделения различных молекул иРНК достаточно хорошо разработана. Успехи в выделении иРНК белка глобина, входящего в состав гемоглобина человека, животных и птиц, иРНК белка хрусталика глаза, иРНК иммуноглобина, иРНК специфического белка злокачественной опухоли (миеломы) позволили с помощью обратной транскриптазы осуществить синтез структурной части генов, кодирующих некоторые из этих белков.

Однако в организме структурные гены функционируют совместно с регуляторными, нуклеотидная последовательность которых не воспроизводится молекулой иРНК. Поэтому ни один из указанных способов не позволяет осуществить синтез совокупности структурного и регуляторного гена. Решение этой проблемы стало возможным после разработки методов выделения отдельных генов. Для выделения бактериальных генов используют небольшие ДНК-содержащие цитоплазматические структуры, способные реплицироваться (см. Репликация) независимо от бактериальной хромосомы. Эти структуры образуют единую группу внехромосомных генетических элементов бактерий - плазмид (см. Плазмиды). Некоторые из них могут внедряться в бактериальную хромосому, а затем спонтанно либо под воздействием индуцирующих агентов, напр. УФ-облучения, переходить из хромосомы в цитоплазму, захватывая с собой и прилегающие хромосомные гены-клетки хозяина. Внехромосомные генетические элементы бактерий, обладающие такими свойствами, называют эписомами [Ф. Жакоб, Волльман (E. Wollman)]. К эписомам (см.) относят умеренные фаги (см. Бактериофаг), половой фактор бактерий, факторы лекарственной устойчивости микроорганизмов (см.), бактериоциногенные факторы (см.). В цитоплазме гены, захваченные эписомами, реплицируются в их составе и часто образуют множество копий. Разработка эффективного метода выделения плазмид, в частности умеренных фагов, несущих генетический материал бактериальной хромосомы, и выделения включенного в геном бактериофага фрагмента хромосомы бактериальной клетки позволила в 1969 г. Беквиту (J. Beckwith) с соавт, выделить лактозный оперон - группу генов, контролирующих синтез ферментов, необходимых для усвоения кишечной палочкой лактозы. Аналогичная техника была использована для выделения и очистки гена, контролирующего синтез тирозиновой транспортной РНК кишечной палочки (см. Рибонуклеиновые кислоты).

Использование плазмид дает возможность получить в изолированном виде практически любые бактериальные гены, а следовательно, и возможность конструировать молекулы ДНК из различных источников. Такие гибридные структуры можно накопить в клетках в значительных количествах, поскольку многие плазмиды в определенных условиях интенсивно реплицируются в цитоплазме бактерий, образуя десятки, сотни и даже тысячи копий.

Успехи Г. и. связаны с разработкой техники объединения генетических структур из различных источ-i ников в одной молекуле ДНК. Решающим в конструировании гибридных молекул in vitro явилось использование эндонуклеаз рестрикции - особых ферментов, способных разрезать молекулы ДНК в строго определенных участках. Такие ферменты обнаружены в клетках Escherichia coli, несущих плазмиды типа R, обусловливающие устойчивость бактерий к нек-рым лекарственным препаратам, в клетках Haemophilus influenzae, Serratia marcescens и других микроорганизмов. Один из наиболее часто используемых ферментов этого типа - эндонуклеаза рестрикции EcoRI, синтезируемая плазмидой RI в клетках E. coli. Фермент распознает участок ДНК с уникальной последовательностью из шести пар нуклеотидов и разрезает двунитчатую структуру ДНК на этом участке т. о., что с обеих сторон образуются однонитевые концы из четырех нуклеотидов (так наз. липкие концы). Поскольку фермент разрезает молекулы ДНК независимо от их происхождения строго определенным образом, все образовавшиеся в результате действия фермента фрагменты ДНК будут иметь одни и те же липкие концы. Комплементарные липкие концы любых фрагментов ДНК объединяются водородными связями, образуя гибридную кольцевую ДНК (рис.). Для стабилизации гибридной молекулы ДНК используют другой фермент - полинуклеотидлигазу, восстанавливающую ковалентные связи, разорванные ферментом рестрикции. Последовательность, специфично распознаваемая EcoRI, встречается в ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пар нуклеотидов. Следовательно, фрагмент ДНК, образовавшийся под действием EcoRI, может включать по крайней мере один неповрежденный ферментом ген (один ген в среднем содержит 1000-1500 пар нуклеотидов).

Применение эндонуклеаз рестрикции и ряда других ферментов дает возможность получать сложные рекомбинантные ДНК. Группа исследователей в США под руководством Берга (P. Berg) сумела объединить в составе одной молекулы ДНК генетическую информацию из трех источников: полный геном (см.) онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага λ и группу генов кишечной палочки, ответственных за усвоение галактозы. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку авторы этой работы остановились перед потенциальной опасностью распространения онкогенных вирусов животных в популяции бактерий, обитающих в кишечнике человека. Известно, что очищенная ДНК вирусов может проникать в различные клетки млекопитающих и стабильно наследоваться ими.

Впервые функционально активные молекулы гибридной ДНК удалось сконструировать в США Коэну (S. Cohen) с соавт. Группа Коэна последовательно решала проблему объединения и клонирования (избирательного накопления) молекул ДНК, выделенных из видов, все более удаленных друг от друга в филогенетическом отношении. Процедура клонирования обычно заключается в том, что ДНК из различных источников фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции, затем эти фрагменты объединяют in vitro в общую структуру и вводят в реципиентный организм, к-рым в опытах Коэна служит кишечная палочка. Установлено, что клетки нескольких видов бактерий (в т. ч. Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) могут быть трансформированы (см. Трансформация) с помощью рекомбинантных молекул ДНК. При этом плазмидная часть гибридной молекулы (либо одна из плазмид, если в составе гибридной молекулы объединены две плазмиды из различных источников) служит вектором, т. е. обеспечивает перенос в реципиентные клетки филогенетически чужеродного генетического материала и его размножение в них. Первой плазмидой, использованной Коэном с соавт, в качестве вектора, была полученная им in vitro плазмида pSC101, контролирующая устойчивость бактерий к тетрациклину. Эта небольшая плазмида состоит всего из 8000 пар нуклеотидов. Она атакуется ферментом EcoRI лишь в одном участке, причем фермент не повреждает способность плазмиды к последующей репликации в клетках E. coli и контролировать устойчивость к тетрациклину. Эти особенности позволили использовать ее для конструирования in vitro гибридных молекул ДНК. На первых этапах к pSC101 присоединили плазмидную ДНК, выделенную из различных видов бактерий, а затем и из высших организмов. Так были созданы «химерные» плазмиды (т. е. не способные возникать в природных условиях), объединившие в своем составе генетический материал кишечной палочки, участок ДНК из ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, контролирующий синтез рибосомных РНК, и участок ДНК морского ежа, контролирующий синтез белков- гистонов, либо ДНК митохондрий мыши. В клетках кишечной палочки, в которые вводили такие гибридные, «химерные», плазмиды, была зарегистрирована работа генов высших организмов.

В отличие от pSC101, присутствующей в клетке лишь в 4-6-й копиях, некоторые другие плазмиды, используемые в качестве векторов, в определенных условиях могут многократно реплицироваться, образовывая несколько тысяч копий в одной клетке. Такими свойствами обладает, напр., плазмида ColEI, контролирующая синтез колицина (см. Бактериоциногения). Подобно pSC101, ColEI разрезается ферментом EcoRl лишь в одном участке, а к образовавшейся линейной молекуле с липкими концами легко присоединяется чужеродная ДНК, также обработанная EcoRI. Т. о., к ColEI удалось «подшить» гены триптофанового оперона кишечной палочки. В клетках, несущих множество копий сконструированной гибридной плазмиды, резко увеличилась продукция белков-ферментов, контролируемых генами биосинтеза триптофана. В системе in vitro удалось присоединить плазмиду ColEI к нек-рым R-факто-рам и умеренному фагу. Подобные работы впервые выполнены в СССР под руководством академика А. А. Баева и профессора С. И. Алиханяна. Комбинированные векторные плазмиды, образованные ColEI и R-факторами, способны интенсивно размножаться в бактериальных клетках, подобно ColEI, и в то же время обусловливают устойчивость клеток к антибиотикам, что значительно упрощает отбор бактерий - носителей гибридных плазмид.

В качестве векторов используют и умеренные фаги. В системе in vitro сконструированы гибридные частицы бактериофага, включившие в свою структуру бактериальные гены, ДНК других фагов либо высших организмов (напр., ДНК плодовой мушки-дрозофилы).

Функциональную активность гибридных ДНК определяют возможностью их переноса в клетки реципиентных организмов и последующего умножения (амплификации) в этих клетках. В качестве реципиентов уже сейчас эффективно используют не только бактерии, о чем упоминалось выше, но и клетки высших организмов, пока, однако, лишь в виде культуры ткани, культивируемой вне организма. Имеются указания на возможность проникновения ДНК фагов, несущих бактериальные гены, в клетки соединительной ткани (фибробласты) человека, в протопласты либо в недифференцированную культуру (каллус) клеток растений. В 1971 г. амер. исследователь Меррил (С. R. Merril) с соавт, сообщил об опытах по исправлению наследственного дефекта - галактоземии (см.) путем введения в «больные» клетки галактозных генов бактерий, включенных в состав ДНК трансдуцирующего фага. В результате клетки больного галактоземией, дефектные по ферменту бета-D-галактозо-1-фосфатуридилтрансферазе, не способные усваивать галактозу, восстанавливали нормальную способность к росту в присутствии галактозы, а в их экстрактах была зарегистрирована ранее отсутствовавшая ферментативная активность. Сходный результат был получен Хорстом (J. Horst) с соавт, при введении бактериального гена, контролирующего синтез бета-галактозидазы в фибробласты больного с генерализованным ганглиозидозом, характеризующимся резкой недостаточностью этого фермента. Маньон (W. Munyon) и его сотр. с помощью вируса герпеса перенесли ген, контролирующий синтез тимидинкиназы, из клеток человека в клетки мыши, восстановив способность дефектных мышиных фибробластов синтезировать этот фермент.

Одним из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений является гибридизация соматических клеток, разработанная Эфрусси (В. Ephrussi) и Барски (G. Barski). Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых различных источников. Продемонстрирована возможность передачи отдельных генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, в которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Развитие методов микрохирургии клеток позволило пересаживать клеточные ядра из соматических клеток в оплодотворенные яйцеклетки и получать в результате абсолютно идентичные организмы. Гибридизация клеток дала возможность индуцировать синтез глобина человека в зародышевых клетках лягушки. Все эти примеры демонстрируют потенциальные возможности Г. и.

Практическое значение Г. и. для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов обмена у человека (см. Генотерапия), создания микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета, синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов, иммуноглобулинов и т. д., основанного на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены. Исключительные результаты могут быть получены в ближайшее время Г. и. растений. С помощью методов Г. и. пытаются создать растения, способные усваивать атмосферный азот, и улучшить белковый состав растительной пищи. Успешное решение этих задач позволит резко повысить продуктивность растений, сократить производство и потребление минерального азота, а тем самым значительно оздоровить окружающую среду (см.). Изучается возможность создания совершенно новых форм животных и растений за счет преодоления межвидовых барьеров скрещиваемости. Однако при оценке Г. и. как новой формы освоения живой природы следует учитывать не только ее возможную революционизирующую роль в биологии, медицине и сельском хозяйстве, но и возникающие в связи с ее развитием возможности появления новых форм патогенных микроорганизмов, опасность распространения в популяциях бактерий, обитающих у человека, гибридных ДНК, несущих Онкогенные вирусы, и т. д. Конечно, преднамеренное использование достижений науки, и в т. ч. Г. и., в антигуманных, человеконенавистнических целях возможно лишь в обществе, в к-ром благо человека приносится в жертву наживе и агрессии.

Из дополнительных материалов

Генетическая инженерия продолжает оставаться быстро прогрессирующим методом исследования в молекулярной биологии и генетике. Необходимо отметить, что понятия «генетическая инженерия» и «генная инженерия» не являются полными синонимами, т. к. исследования, относящиеся к генетической инженерии, не ограничиваются только манипуляциями с генами как таковыми. В настоящее время методы генетической инженерии позволяют проводить наиболее глубокий и детальный анализ природных нуклеиновых к-т - веществ, ответственных за хранение, передачу и реализацию генетической информации (см. Нуклеиновые кислоты.), а также создавать модифицированные или абсолютно новые, не встречающиеся в природе гены (см. Ген), комбинации генов и с высокой эффективностью экспрессировать их в живой клетке (см. Экспрессивность гена). Из конкретных практических достижений генетической инженерии в последнее десятилетие наиболее важным следует признать создание продуцентов биологически активных белков - инсулина (см.), интерферона (см.), гормона роста (см. Соматотропный гормон) и др., а также разработку генно-инженерных способов активизации тех звеньев обмена веществ, к-рые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных веществ. Таким путем получены продуценты нек-рых антибиотиков, аминокислот и витаминов, во много раз более эффективные, чем продуценты этих веществ, выведенные традиционными методами генетики и селекции. Разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования вакцинации вирусом осповак-цины, в геном к-рого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (напр., вирусов гепатита или гриппа): в результате прививки сконструированным таким образом вирусом организм вырабатывает иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, белок к-рого кодируется встроенным геном.

Существенно выросла мировая коллекция рестрикционных эндонуклеаз - рестриктаз, основных «инструментов» генно-инженерных манипуляций. Выделено более 400 рестриктаз, «узнающих» ок. 100 различных по структуре специфических участков (сайтов) в молекулах ДНК (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты) и расщепляющих полинуклео-тидную цепь ДНК по этим участкам. С помощью одного такого фермента или комбинации нескольких рестриктаз можно выделить практически любой ген в составе одного или нескольких фрагментов ДНК (так наз. рестрикционных фрагментов). Это расширило возможности генетической инженерии не только в отношении выделения генов, но и в отношении активизации их работы, анализа структуры генов и их молекулярного окружения. Разработаны методы синтеза целых генов с заданной последовательностью нуклеотидов, появилась возможность снабжать синтезированные и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять единичные нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его нуклеотидную цепь с точностью до одного нуклеотида.

Достижением генетической инженерии явилось ее проникновение в организацию и функционирование механизмов наследственности клеток высших организмов, в т. ч. и человека. Именно на высших эукариотах с помощью методов генетической инженерии получены наиболее интересные данные. Успехи генетической инженерии во многом связаны с получением новых специализированных векторов, позволяющих эффективно клонировать (размножать) индивидуальные фрагменты ДНК (гены) и синтезировать белки, кодируемые этими генами.

Рестрикционные фрагменты, соединенные с ДНК-векторами, клонируют в живой клетке, используя способность таких векторов воспроизводиться (реплицироваться) в клетке во множестве копий. В зависимости от размеров фрагментов, подлежащих клонированию, и цели исследования используют векторы одного из четырех типов - плазмиды (см.), фаги (см. Бактериофаг), космиды или производные фагов с однонитевой ДНК.

Для клонирования сравнительно небольших фрагментов ДНК (до 10 тыс. пар нуклеотидов) применяют плазмидные векторы (pBR322, рАТ 153, pUR250, pUC19 и др.). Достижением генетической инженерии последних лет было получение векторов на основе фага X (Харон 4А, gtwes-B), в к-ром часть генома замещена фрагментом чужеродной ДНК. Гибридный геном искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Образуя при размножении в клетке несколько тысяч копий, реконструированный фаг лизирует ее и выделяется в культуральную среду. С помощью таких векторов клонируют фрагменты ДНК длиной 10-25 тыс. пар нуклеотидов.

Космидные векторы (pIB8, MUA-3) представляют собой гибрид фага X и плазмиды. Они содержат так наз. COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий кос-мидным векторам реплицироваться в бактериях так же, как это делают плазмиды. Таким образом, полученный рекомбинантный геном с высокой эффективностью заражает бактерии подобно бактериофагу, но размножается в них как плазмида, не вызывая гибели бактериальной клетки. Космиды применяют для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35-45 тыс. пар нуклеотидов.

Векторы, представляющие собой производные фагов с однонитевой ДНК (М13 mp8, М13, тр73 и др.), сконструированы на основе кольцевой молекулы ДНК бактериофага М13. Для встраивания чужеродной ДНК используют репликативную двуспиральную молекулу ДНК фага. Вектор, несущий чужеродную ДИК, вводят в бактериальные клетки, где рекомбинантные молекулы размножаются, не лизируя эту клетку, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусная частица с однонитевой молекулой ДНК. Эти векторы используют для клонирования фрагментов ДНК (до 300-400 пар нуклеотидов).

Ген, необходимый для генно-инженерных манипуляций, получают путем клонирования соответствующих рекомбинантных молекул ДНК и отбора таких клонов. В тех случаях, когда клонируют гены высших организмов и человека/ экспрессия к-рых в E. coli (чаще всего используемой для таких целей) невозможна, процедуру клонирования и отбора проводят в несколько этапов. На первом этапе создают так наз. библиотеку генов из фрагментов ДНК (клонированных непосредственно из генома клетки) или из клонированных ДНК-копий (кДНК) соответствующей матричной РНК. Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующих кДНК, получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней - о характере аномалий в генетическом материале, следствием к-рых и является это заболевание. Из библиотеки генов, пользуясь современными приемами, можно извлечь необходимый ген с окружающими его участками генома. В настоящее время созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Уже клонировано и в той или иной мере изучено несколько сот генов и других последовательностей нуклеотидов в ДНК человека.

Возможности генно-инженерных исследований не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо не только клонировать ген, но и обеспечить его экспрессию в клетке, т. е. реализовать заключенную в нем информацию в аминокислотную последовательность полипеп-тидной цепи белка, кодируемого этим геном. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то бывает достаточно выделить ген с регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, напр., экспрессии эукариотического гена в клетках Е. coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена. Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы Ва131, к-рая обладает уникальным свойством гидролизовать обе цепи двуспиральной линейной молекулы ДНК начиная с конца молекулы, т. е. этот фермент удаляет с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» к-рых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи, затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область эукариотического гена с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов.

Успехи генетической инженерии тесно связаны с развитием и совершенствованием методов определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) в молекулах ДНК. Значительное число рестриктаз, имеющихся в распоряжении исследователей, позволяет с абсолютной специфичностью выделять определенные фрагменты ДНК, а разработка и совершенствование методов клонирования дает возможность получать фрагменты даже уникальных генов в количествах, необходимых для анализа. Методы секвенирова-ния ДНК оказались настолько эффективными, что часто через определение последовательности нуклеотидов ДНК получают данные о последовательности нуклеотидов в молекулах соответствующих РНК и о последовательности аминокислотных остатков в синтезирующейся молекуле белка. При обработке результатов секвенирования ДНК широко используют ЭВМ. Для более полной и быстрой интерпретации полученных экспериментальных данных создаются национальные и международные компьютерные «банки» нуклеотидных последовательностей. В настоящее время определены полные последовательности нуклеотидов геномов ряда бактериальных плазмид и вирусов, уже решается проблема определения полных нуклеотидных последовательностей сначала отдельных хромосом, а затем и всего генома высших организмов, в т. ч. и человека.

С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, что являлось причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так наз. б лот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают гидролизу рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза в агарозе или полиакриламидном геле. Разделенные фрагменты переносят («перепечатывают») на специально обработанную хроматографическую бумагу, нитроцеллюлозу или нейлоновый фильтр и снова подвергают электрофоретическому разделению. Вырезают места электрофореграмм, соответствующие отдельным фракциям и содержащие однотипные фрагменты ДНК; вырезанные участки электрофореграмм инкубируют с ранее клонированным геном или его частью либо с полученной путем хим. синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащими радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, к-рые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов. Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов.

Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при гидролизе этими ферментами молекула ДНК расщепляется на ряд фрагментов различной длины. Перестройка структуры ДНК, в результате к-рой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания», приводит к изменению набора этих фрагментов (так наз. рестрикционных фрагментов), т. е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов(ГВДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена.

Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ (см.) проводится в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке: выбирают фрагмент ДНК с неизвестной функцией, устанавливают сцепление этого фрагмента ДНК с другими областями генома и его связь с определенными признаками. Этот подход позволил разработать методы ранней диагностики и выявления носителей таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшен-на, муковисцидоз, биохимическая природа наследственных дефектов при к-рых пока не известна. При генеалогическом методе установления закономерностей наследственной передачи хореи Гентингтона было показано, что выделенный из генома человека фрагмент ДНК G8 тесно сцеплен с геном, определяющим заболевание, и по форме ПДРФ фрагмента G8 в данной популяции можно диагностировать это заболевание и выявлять носителей дефектных генов.

На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение, если и не для массового генетического просеивания (скрининга) при диспансеризации населения, то, но крайней мере, для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.

Генетическая инженерия позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах нек-рых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами генетической инженерии проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена строго определенных аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.

В области сельского хозяйства от генетической инженерии ожидают большого вклада в селекцию новых высокоурожайных сортов растений, устойчивых к засухе, болезням и вредителям, а также в выведение новых высокопродуктивных пород с.-х. животных.

Как и любое достижение науки, успехи генетической инженерии могут быть использованы не только на благо, но и во вред человечеству. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения рекомбинантных ДНК не так велика, как представлялось ранее. Рекомбинантные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, к-рые обеспечивают активный обмен генетической информацией, это так наз. поток генов. Однако на пути проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. В настоящее время очевидно, что при работе с большинством рекомбинантных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, к-рые применяют, напр., микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы как биологической защиты, так и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды. Поэтому весьма жесткие первые варианты правил работы с рекомбинантными ДНК были переработаны и значительно смягчены. Что касается преднамеренного использования достижений генетической инженерии во вред человеку, то и ученые, и общественность должны активно бороться за то, чтобы эта опасность так и осталась возможной лишь теоретически.

См. также Биотехнология.

Библиография: Алиханян С. И. Успехи и перспективы генной инженерии, Генетика, т. 12, Jvft 7, с. 150, 1976, библиогр.; АлиханянС. И. и др. Получение функционирующих рекомбинантов (гибридных) молекул ДНК, in vitro, там же, т. И, № 11, с. 34, 1975, библиогр.; Баев А. А. Генетическая инженерия, Природа, М1,с. 8, 1976; Тихомирова Л. П. и д р. Гибридные молекулы ДНК фага X и плазмиды ColEl, Докл. АН СССР, т. 223, №4, с. 995, 1975, библиогр.; Brown D. D. a. S t e r n R. Methods of gene isolation, Ann. Rev. Biochem., v. 43, p. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Studies of mouse mitochondrial DNA in Escherichia coli, Cell, v. 6, p. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. DNA nucleotide sequence restricted by the R1 endonuclease, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 69, p. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA, ibid., v. 71, p. 3455, 1974; Morrow J. F. a. o. Replication and transcription of eukaryotic DNA in Escherichia coli, ibid., p. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus, Nature (Lond.), v. 226, p. 1211, 1970.

Биотехнология, под ред. А. А. Баева, М., 1984; Б о ч к о в Н. П., Захаров А. Ф. и Иванов В. И. Медицинская генетика, М., 1984; М а н и а-тис Г., ФричЭ. и Сэмбрук Д ж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, пер. с англ., М., 1984; A n t о n a r a k i s S. E. a. o. DNA polymorphism and molecular pathology of human globin gene clusters, Hum. Genet., v. 69, p. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliography of cloned human and other selected DNAs, Amer. J. hum. Genet., v. 37, p. 386, 1985; В o t s t e i n D. a. o. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms, ibid., v. 32, p. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. DNA markers for nervous system diseases, Science, v. 225, p. 1320, 1984; Motulsky A. G. Impact of genetic manipulation on society and medicine, ibid., v. 219, p. 135, 1983; White R. a. o. A closely linked genetic marker for cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, p. 382, 1985; Wo о S. L. C., L i d s к у A. S. a. Guttler F. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by gene mapping, J. Amer. med. Ass., v. 251, p. 1998, 1984.

Л. С. Чернин, В. H. Калинин.

Министерство Сельского Хозяйства Российской Федерации

ФГОУ ВПО «Уральская Государственная сельскохозяйственная Академия»

по дисциплине «Ветеринарная генетика»

на тему: «Генная инженерия – настоящее и будущее»

Выполнила:

Студентка ФВМ

2 курс 2 группа 3 п/группа

Шмакова Т.С.

Проверила:

Ерофеева Л.Ф.

Екатеринбург 2008

Введение

1. Методы генной инженерии

2. Достижения генной инженерии

3. Генная инженерия: за и против

4. Перспективы генной инженерии

Список использованной литературы

Введение

Генная инженерия – совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. Самым ярким событием, привлёкшим наибольшее внимание и очень важным по своим последствиям, была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, причём управления путём проникновения в «святая святых» живой клетки – в её генетический аппарат.

Современный уровень наших знаний биохимии, молекулярной биологии и генетики позволяет рассчитывать на успешное развитие новой биотехнологии – генной инженерии , т.е. совокупности методов, позволяющих путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии – не воплощение в реальность мифов, а получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые «человеческие» белки.

1. Методы генной инженерии

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (т.е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Большая часть таких препаратов – антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они проникают в бактерии, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга, разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра участка узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты» (их еще называют «липкими» концами).

Весь процесс получения бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1. Рестрикция – разрезание ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигитирование – включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформация – введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом – так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высеивают на питательную среду, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

4. Скрининг – отбор среди клонов тех бактерий, которые несут нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд – это полинуклеотид комплементарной части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном.

Не всегда удается вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой, комплетентарной второй цепи ДНК.

Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Чтобы осуществить перенос генов, необходимо выполнить следующие операции:

·Выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса.

·Создание специальных генетических конструкций, в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида.

·Внедрение генетических конструкций сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы.

2. Достижения генной инженерии

генная инженерия биотехнология наследственность

Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.

Так, в 1980 году гормон роста – соматотропин – получили из бактерии кишечной палочки. До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободными от вирусных загрязнений.

В 1982 году гормон инсулин стали получать в промышленных масштабах из бактерий, содержащих ген человеческого инсулина. До этого времени инсулин выделяли из поджелудочных желез забиваемых коров и свиней, что сложно и дорого.

Интерферон – белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.

В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.

3. Генная инженерия: за и против

Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие «генная инженерия» породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.

Генная инженерия – это мощный способ изменить жизнь, но ее потенциал может представлять опасность, причем в первую очередь надо учитывать сложные и трудно предсказуемые эффекты, связанные с возможным воздействием на окружающую среду. Представьте себе некий яд, более дешевый в производстве, чем сложные гербициды с избирательным действием, но который не может быть использован в агротехнике из-за того, что он убивает полезные растения наравне с сорняками. Теперь представьте, что, допустим, в пшеницу, внедрили ген, делающий ее устойчивой к этому яду. Фермеры, засеявшие свои поля трансгенной пшеницей, могут безнаказанно опылять их смертоносным ядом, увеличивая свои доходы, но нанося непоправимый вред окружающей среде. С другой стороны, генетики могут достичь и противоположного эффекта, если выведут такую культуру, которая не нуждается в гербицидах.

Генная инженерия бросила человечеству уникальный вызов. Что несет нам генная инженерия, счастье или беду? О возможной опасности генетически измененных продуктов для здоровья человека трубит уже весь мир. Однозначного и единого мнения ученых по этому поводу нет. Одни считают, что генная инженерия спасет человечество от голодной смерти, другие – что генетически измененные продукты погубят все живое на земле вместе с человеком. Ученые, занимающиеся этим, утверждают, что генетически измененные растения более урожайны, более устойчивы к ядохимикатам, экономически выгоднее обычных. Поэтому за ними будущее. Однако специалисты, не связанные с производителями данного товара, далеки от оптимизма.

Предугадать отдаленные последствия, которые могут наступить в результате потребления генетически измененной продукции, на данный момент вообще невозможно. Относительно спокойно относятся к ГМ – продуктам (генетически модифицированным) – в США, где выращивается сегодня около 80 процентов всех генетических культур. Европа же относится к этому крайней негативно. Под натиском общественности и организаций потребителей, которые хотят знать, что они едят, в некоторых странах введен мораторий на ввоз таких продуктов (Австрия, Франция, Греция, Великобритания, Люксембург).

В других принято жесткое требование маркировать генетически измененное продовольствие, что, естественно, очень не понравилось поставщикам. 1 июля 2000 года в России была запрещена продажа генетически измененных продуктов без специальной предупредительной надписи на упаковке. Одним из первых ученых, забивших тревогу о потенциальной опасности ГМ – продуктов, был британский профессор Арпад Пуштай. Он назвал их “пищей для зомби”. Такие выводы позволили сделать результаты опытов на крысах, которых кормили генетически модифицированной пищей. У животных возник целый набор серьезных изменений желудочно-кишечного тракта, печени, зоба, селезенки. Наибольшее беспокойство вызвал тот факт, что у крыс уменьшился объем мозга.

Ученые полагают, что с помощью генетически измененных растений можно сократить потери урожая. Сегодня в России завершаются испытания американского картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Возможно, уже в этом году будет получено разрешение на его промышленное производство. Есть у подобных сортов одно существенное “но”. Когда получают растение с резко повышенной устойчивостью к какому-либо вредителю, через два-три поколения этот вредитель приспособится к растению, и будет пожирать его еще сильнее. Следовательно, устойчивый картофель может породить таких агрессивных вредителей, с которыми мир еще не сталкивался.

4. Перспективы генной инженерии

Настоящей находкой для генетиков стал янтарь, ископаемая древесная смола. В доисторические времена в ней часто застывали насекомые, цветочная пыльца, споры грибов, остатки растений. Текучая смола герметично обволакивала своих пленников, и биологический материал в целости и сохранности поджидал современных исследователей. И вот в 1990 году Джордж О. Пойнар из Калифорнийского университета сделал сенсационное открытие. Изучая термитов, попавших в янтарь 40 миллионов лет назад, он нашел хорошо сохранившуюся генетическую информацию. Позднее Пойнару удалось выделить из янтаря ДНК долгоносика, жившего 120 миллионов лет назад! Сейчас многие ученые работают над тем, чтобы воскресить динозавров, древних ящеров, мамонтов. И это уже не кажется фантастикой, как было всего лишь несколько лет назад. Однако ученые не намерены останавливаться на воскрешении животных. Если можно воскресить их, следовательно, то же самое можно проделать и с людьми.

Развитие науки дает нам потенциал как для плохого, так и для хорошего. Поэтому важно, что бы мы сделали правильный выбор. Основная трудность носит политический характер, – это решение вопроса кто есть «мы» в этом предложении. Если оставить этот вопрос на произвол рыночной стихии, скорее всего, пострадают долгосрочные интересы окружающей среды. Но это можно сказать и про многие другие аспекты жизни.

Список использованной литературы

1. Нейман Б.Я. Индустрия микробов. – Знание, 1983.

2. Рувинский А.О. Общая биология. – Просвещение, 1994.

3. Чебышев Н.В. Биология. − Новая волна, 2005.

Генная инженерия

Материал из Википедии - свободной энциклопедии

Ге́нная инжене́рия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

1 Экономическое значение

2 История развития и достигнутый уровень технологии

3 Применение в научных исследованиях

4 Генная инженерия человека

5 Примечания

7 Литература

Экономическое значение

Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путем использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых - способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение - аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку - от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна - добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат - получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 110 °C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение - полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

[править]

История развития и достигнутый уровень технологии

Во второй половине ХХ века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии. Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начата английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом (Нобелевская премия по химии 1980 г.). Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов. Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения генноинженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100-120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты - олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице веделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты - рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).

Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, т.е. отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с измененным генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идет о животных. В результате рождаются детеныши с измененным или неизмененным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

Применение в научных исследованиях

Генетический нокаут. Для изучения функции того или иного гена может быть применен генетический нокаут. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генноинженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки и замещают ею нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисты суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искуственная экспрессия. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспресия, т.е. добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

Мечение генных продуктов. Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка (GRF). Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации. Хотя такая техника удобна и полезна, ее побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощренным, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.

Исследование механизма экспрессии. В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для сязывания факторов транскрипции. Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, того же GFP или фермента, катализирующего хорошо детектируемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.

[править]

Генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия . Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребенок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей. При помощи генной инженерии можно получать потомков с измененной внешностью, умственными и физическими способностьями, характером и поведением. В принципе можно создавать и более серьезные изменения, но на пути подобных преобразований человечеству необходимо решить множество этических проблем.

Примечания

BBC News. news.bbc.co.uk. Проверено 2008-04-26 г.

Литература

Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - Москва, 1998.

Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. - Москва, 1981.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.

Генетическая инженерия

Современная биология коренным образом отличается от традиционной биологии не только большей глубиной разработки познавательных идей, но и более тесной связью с жизнью общества, с прак- тикой. Можно сказать, что в наше время биология стала средством преобразования живого мира с целью удовлетворения материальных потребностей общества. Это заключение иллюстрируется прежде всего тесной связью биологии с биотехнологией, которая стала важнейшей областью материального производства, равноправным партнером механической и химической технологий, созданных чело- веком, а также с медициной.

С момента своего возникновения биология и биотехнология всегда развивались совместно, причем с самого начала биология была научной основой биотехнологии. Однако длительное время недостаток собственных данных не позволял биологии оказывать очень большое влияние на биотехнологию. Положение резко изменилось с созданием во второй половине XX в. методологии генетической инженерии, под которой понимают генетическое манипулирование с целью конструкции новых и реконструкции существующих генотипов. Являясь по своей природе методическим достижением, генетическая инженерия не привела к ломке сложившихся представлений о биологических явлениях, не затронула основных положений биологии подобно тому, как радиоастрономия не поколебала основных положений астрофизики, установление «механического эквивалента тепла» не привело к изменению законов теплопроводности, а доказательство атомистической теории вещества не изме- нило соотношений термодинамики, гидродинамики и теории упругости (А.А. Баев).

Тем не менее генетическая инженерия открыла новую эру в биологии по той причине, что появились новые возможности для про- никновения в глубь биологических явлений с целью дальнейшей характеристики форм существования живой материи, более эффективного изучения структуры и функции генов на молекулярном уровне, понимания тонких механизмов работы генетического аппарата. Успехи генетической инженерии означают переворот в современном

естествознании. Они определяют критерии ценности современных представлений о структурно-функциональных особенностях молекулярного и клеточного уровней живой материи. Современные данные о живом имеют гигантское познавательное значение, ибо обеспечивают понимание одной из важнейших сторон органического мира и тем самым вносят неоценимый вклад в создание научной картины мира. Таким образом, резко расширив свою познавательную базу, биология через генетическую инженерию оказала также ведущее влияние на подъем биотехнологии.

Генетическая инженерия создает заделы на пути познания способов и путей «конструирования» новых или улучшения существующих организмов, придавая им большую хозяйственную ценность и способность резкого увеличения продуктивности биотехнологических процессов. Однако генетическая инженерия создала новые горизонты и для медицины по линии диагностики и лечения многих болезней, как ненаследственных, так и наследственных. Она открыла новые пути в поисках новых лекарств и материалов, используемых в медицине. Генетическая инженерия и биотехнология стимулировали разработку методов бионанотехнологии.

В рамках генетической инженерии различают генную и клеточную инженерию. Под генной инженерией понимают манипуляции с целью создания рекомбинантных молекул ДНК. Часто эту методологию называют молекулярным клонированием, клонированием генов, технологией рекомбинантных ДНК или просто генетическими манипуляциями. Важно подчеркнуть, что объектом генной инженерии являются молекулы ДНК, отдельные гены. Напротив, под клеточной инженерией понимают генетические манипуляции с изолированными отдельными клетками или группами клеток растений и животных.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И ЕЕ ИНСТРУМЕНТЫ

Генную инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию), клонирование молекул ДНК и генов с заданными целями.

Методы генной инженерии используют в определенной последовательности (рис. 127), причем различают несколько стадий в выпол-

нении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:

1. Выделение плазмидий ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.

2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрицируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.

3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.

4. Введение рекомбинантных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например в Е. coli или соматические клетки.

5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.

6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.

7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвентирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.

Рис. 127. Последовательные стадии генно-инженерного эксперимента

В ходе эволюции бактерии развили способность синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали частью клеточной (бактериальной) системы рестрикциимодификации. У бактерий системы рестрикции-модификации являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК. В отличие от высших организмов, у которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых они обитают) происходит внутриклеточно, т.е. тогда, когда чужеродная ДНК проникает в цитоплазму бактерий. С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность «метить» собственную ДНК метилирующими основаниями на определенных последовательностях. По этой же причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метильных групп на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными бактериальными рестриктазами, а затем деградируется бактериальными экзонуклеазами до нулеотидов. Можно сказать, что таким образом бактерии защи- щают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты).

Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г. Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инже- нерии. Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.

Действие системы рестрикции-модификации «рационализуется» так называемыми палиндромными (распознающими) последователь- ностями азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК. Палиндромные последовательности - это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар. Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5" - к 3"-концу на верхней и на нижней цепи от 3" - к 5"-концу, а именно:

Палиндромы могут быть любых размеров, но большинство тех палиндромов, которые используют в качестве сайтов узнавания рестриктазами, состоят из 4, 5, 6 и реже 8 оснований.

Рестриктазы - это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.

Замечательной особенностью рестриктаз является то, что они продуцируют разрезы молекул на несколько фрагментов (рестриктов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов, так как они способны к самокомплементарности.

Рассмотрим результаты рестрикции на примере одной из наиболее известных рестриктаз Eco RI из системы рестрикция-модификация Е. соИ. Вместо того чтобы плавить ДНК в центре палиндромной последовательности узнавания, этот фермент плавит ДНК за преде- лами центра и продуцирует 4 самокомплементарных («липких») конца, состоящих из разного количества нуклеотидов, а именно:

Эти «липкие» концы в генно-инженерных опытах полезны по той причине, что они могут быть воссоединены комплементарно при низких температурах, что позволяет эффективное смыкание ДНК-фрагментов.

Сайты распознавания и сайты плавления в случае других рестриктаз имеют другое содержание, а именно:

Вслед за рестрикцией ДНК из рестрикционной смеси выделяют рестрикционные ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты), которые необ- ходимы затем для объединения с вектором. Для выделения ДНКрестриктов прибегают к электрофорезу, поскольку с помощью этого метода рестрикцированную ДНК очень легко фракционировать благодаря размерам фрагментов-рестриктов и константным отношениям электрический заряд-масса. Фрагменты в электрическом поле мигрируют в ходе электрофореза при частоте, зависимой от их размеров (массы). Чем больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее он мигрирует в электрическом поле. Материалом, в котором проводят электрофорез, являются незаряжающиеся агароза или полиакриламид. Для опознания фрагментов используют этидий бромид, который красит фрагменты, что ведет к их более легкому обнаружению.

Результативность электрофореза очень высока, поскольку с его помощью могут быть разделены фрагменты, размеры которых состав- ляют от 2 до 50 000 оснований.

После электрофореза фрагменты из агарозы выделяют с помощью разных методов. На основании результатов сравнения размеров

рестриктов одной и той же ДНК, полученных с помощью разных рестриктаз, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктаз. В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестриктов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК локусов тех или иных генов.

Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции.

Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть сек-вентированию, т.е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого служат химический и ферментативный методы секвентирования. Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32 Р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов in vitro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически. Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют

также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн-

и Саузерен-блоттинги.

Генетические векторы. Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т.е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами. Последние должны обладать как минимум двумя свойствами. Во-первых, векторы должны быть способны к репликации

в клетках, причем в нескольких концах. Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т.е. обладать маркером, на который можно вести контрселекцию клеток, содержащих вектор вместе с клонируемым геном (рекомбинантные молекулы ДНК). Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги. Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК

(рис. 128).

Рис. 128. Вектор pBRl

Поскольку не существует природных плазмидных векторов, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Например, плазмидый вектор pBR 322, который имеет гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным

для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов- рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I.

Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазменными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате инфицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага лямбда.

Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК.

Если клонирование генов проводят, используя клетки млекопитающих или растений, то требования к векторам те же, что и в случае клонирования в бактериальных клетках.

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК. Непосредственное конструирование рекомбинантных молекул ДНК следует после того, как получены рестрикты исследуемой ДНК и векторной ДНК. Оно заключается в смыкании сегментов-рестриктов исследуемой ДНК с рестриктом векторной ДНК, которая в результате рестрикции превращается из кольцевой в линейную ДНК.

Чтобы сомкнуть фрагменты исследуемой ДНК с ДНК вектора, используют ДНК-лигазу (рис. 129). Лигирование будет успешным, если смыкаемые структуры обладают З"-гидроксильной и 5"-фос- фатной группами и если эти группы расположены соответствующим образом относительно одна другой. Фрагменты объединяются через их «липкие» концы в результате самокомплементарности. При высоких концентрациях фрагментов последние время от времени становятся в правильное положение (напротив друг друга). Многие рестриктазы, такие как Eco RI, продуцируют «липкие» концы, состоящие из четырех оснований. Процесс лигирования «липких» концов, состоящих из четырех оснований, происходит при пониженной температуре (до 12 ?С).

Рис. 129. ДНК-лигирование

Если при рестрикции образуются фрагменты без «липких» концов, то их «насильственно» конвертируют в молекулы с «липкими» концами, используя фермент трансферазу. Этот фермент добавляет нуклеотиды к 3"-концу ДНК. На одном фрагменте может быть добавлен поли-А-хвост, на другом - поли-Т-хвост. Для генерации любых желаемых концов ДНК используют также полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Принцип ПЦР основан на денатурации выделенной из клеток ДНК и «отжиге» ее с добавлением к ренатурирующимся цепям ДНК-олигонуклеотидов, состоящих из 15-20 нуклеотидов каждый. Эти олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательностям в цепях, разделенных расстояниями в 50-2000 нуклеотидов. Будучи «затравкой» для синтеза ДНК in vitro, они позволяют ДНК-полимеразе копировать те участки, которые находятся между «затравками». Это копирование дает большое количество копий изучаемого фрагмента ДНК.

Введение рекомбинантных молекул ДНК в клетки. После смыкания интересующего фрагмента ДНК (гена) с генетическим вектором с помощью ДНК-лигазы образованные рекомбинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация Е. coli. С этой целью бактериальные клетки предварительно обрабатывают кальцием или рубидием (ионами), для того

чтобы они стали «компетентными» в восприятии рекомбинатной ДНК. Чтобы повысить частоту проникновения ДНК в клетки, используют метод электропорации, заключающийся в кратком экспонировании клеток в интенсивном электрическом поле. Эта обработка создает полости в мембранах клеток, что способствует лучшему восприятию клетками ДНК. После введения рекомбинатных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА (мясо-пептонный агар), обогащенный антибиотиками для селекции желаемых клеток, т.е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Частота трансформации является невысокой. Обычно один трансформант возникает на 10 5 высеянных клеток. Если же вектор является фаговым, то прибегают к трансфекции клеток (бактерий или дрожжей) фагом. Что касается соматических клеток животных, то их трансфекцию осуществляют ДНК в присутствии химических веществ, облегчающих прохождение ДНК через плазматические мембраны. Возможны также прямые микроинъекции ДНК в овоциты, в культивируемые соматические клетки и в эмбрионы млекопитающих.

Важнейшим моментом, связанным с молекулярным клонированием, является поиск способа, позволяющего установить, действитель- но ли клонируемый фрагмент включился в вектор и вместе с вектором, образовав рекомбинатную молекулу ДНК, вошел в клетки. Если речь идет о бактериальных клетках, то один из способов основан на учете инсерционной инактивации плазмидного (векторного) гена резистентности. Например, в плазмидном векторе pBR 322, детерминирующем резистентность к ампициллину и тетрациклину, един- ственный сайт для рестриктазы Pst I находится в локусе, занимаемом геном резистентности к ампициллину. Pst I-плавление на этом сайте генерирует «липкие» концы, позволяющие лигирование клонируемого фрагмента с векторной ДНК. Однако при этом плазмидный (векторный) ген ампициллинрезистентности инактивируется, тогда как ген тетрациклинрезистентности на векторе остается интактным. Именно ген тетрациклинрезистентности и используется для селекции клеток, трансформируемых рекомбинантными молекулами ДНК. Это позволяет убедиться, что клетки выросших колоний на среде с тетрациклином действительно содержат рекомбинантные молекулы ДНК, их проверяют с помощью так называемого «спот-теста» на паре чашек с плотной средой, одна из которых содержит ампициллин, тогда как другая лишена этого антибиотика. Клонируемые ДНК находятся

лишь в трансформантах, резистентных к тетрациклину. Что касается трансформантов, резистентных одновременно к ампициллину и тетрациклину (АрТс), то они содержат плазмидные (векторные) молекулы, которые спонтанно приобрели кольцевую форму без включения в них чужеродной (клонируемой) ДНК.

Другой способ обнаружения инсерции чужеродных (клонируемых) фрагментов в плазмидный вектор основан на использовании вектора, содержащего ген β-галактозидазы. Инсерция чужеродной ДНК в этот ген неизбежно инактивирует синтез β-галактозидазы, что может быть обнаружено посевом трансформированных клеток на среду, которая содержит субстраты β-галактозидазы. Эта среда позволяет селекцию окрашенных колоний клеток. Существуют и другие методы.

Как уже отмечено, рестрикционные линейные фрагменты векторной ДНК способны к восстановлению кольцевой структуры без включения в них клонируемых сегментов. Чтобы уменьшить частоту спонтанного образования таких кольцевых молекул векторной ДНК, рестрикты векторной ДНК обрабатывают фосфатазой. В результате этого образование кольцевых молекул ДНК становится невозможным, поскольку будут отсутствовать концы 5"-РО 4 , необходимые для действия лигазы.

Совокупность колоний-трансформантов, выросших на селективной среде, представляет собой совокупность клеток, содержащих клоны разных фрагментов (генов) клонируемой геномной или кДНК. Коллекции этих клонов формируют так называемые библиотеки ДНК, широко используемые в генно-инженерных работах.

Заключительной стадией клонирования генов является выделение и исследование клонированной ДНК, включая секвенирование. Перспективные штаммы бактерий или соматических клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, которые контролируют синтез интересующих белков, имеющих коммерческую ценность, передают в промышленность.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Как отмечено в начале главы, клеточной инженерией называют генетические манипуляции с изолированными клетками животных и растений. Эти манипуляции часто осуществляют in vitro, а главной целью они имеют получение генотипов этих организмов с заданными свойствами, в первую очередь хозяйственно полезными. Что касает-

ся человека, то клеточная инженерия оказалась применимой к его половым клеткам.

Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их сома- тических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворения у человека и животных. Начиная с 60-х гг. ХХ в. в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклетки (см. гл. IV).

На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. XX в. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных» детей составляет уже десятки тысяч (рис. 130). В России работы по получению «пробирочных» детей были начаты только в 1986 г.

В 1993 г. была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro путем разделения эмбрионов на бласто- меры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины.

Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных» детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодот- ворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных - приемных матерей. Суть этой технологии сводится к следую-

щему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародыши вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.

Рис. 130. «Пробирочные» дети

Другой областью клеточной инженерии у животных является создание трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена и, кроме того, они будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова, и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенных ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки

с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами. В главе IV мы рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводили в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овцедонору. Пример - овца Долли. Получены также клоновые телята, мыши, кролики, кошки, мулы и другие животные. Такое конструирование трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно полезными признаками, включая особей определенного пола.

Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам. В частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело к возникновению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на воз- можность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе создания хозяйственно ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.

Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе даль- нейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных.

На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммунологических исследований возникла проблема, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Как отмечено выше, антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включая резус-фактор. Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа или, как их называют, моноклональные антитела.

В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ гибридизации между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название «гибри- домные». От «лимфоцитарной» части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря «опухолевой (миэломной)» части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размно- жаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридов. На рис. 131 показана схема выделения клеточных линий, синтезирующих моноклональные антитела. Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого

желаемым антигеном. Слияния клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридом проводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных. Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количе- ства антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней. В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.

Рис. 131. Получение моноклональных антител

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И МЕДИЦИНА

Генная инженерия оказалась очень перспективной для медицины, прежде всего в создании новых технологий получения физиологически активных белков, используемых в качестве лекарств (инсулин, соматостатин, интерфероны, соматотропин и др.).

Инсулин используют для лечения больных диабетом, который стоит на третьем месте (после болезней сердца и рака) по частоте вызываемых смертельных случаев. Мировая потребность инсулина составляет несколько десятков килограммов. Традиционно его получают из панкреатических желез свиней и коров, но гормоны этих животных слегка отличаются от инсулина человека. Инсулин свиней различается по одной аминокислоте, а коровий - по трем. Считают, что инсулин животных часто вызывает побочные эффекты. Хотя химический синтез инсулина осуществлен давно, но до сих пор промышленное производство гормонов оставалось очень дорогим. Сейчас получают дешевый инсулин с помощью генно-инженерного метода путем химико-ферментативного синтеза гена инсулина с последующим введением этого гена в кишечную палочку, которая затем синтезирует гормон. Такой инсулин более «биологичен», так как химически идентичен инсулину, вырабатываемому клетками поджелудочной железы человека.

Интерфероны - белки, синтезируемые клетками главным образом в ответ на заражение организма вирусами. Интерфероны характери- зуются видовой специфичностью. Например, у человека установлены три группы интерферонов, продуцируемых различными клетками под контролем соответствующих генов. Интерес к интерферонам определяется тем, что их широко используют в клинической практике для лечения многих болезней человека, особенно вирусных.

Имея крупные размеры, молекулы интерферона мало доступны для синтеза. Поэтому большинство интерферонов сейчас получают из крови человека, но выход при таком способе получения небольшой. Между тем потребности в интерфероне исключительно велики. Это поставило задачу изыскать эффективный метод производства интерферона в промышленных количествах. Генетическая инженерия лежит в основе современного производства «бактериального» интерферона.

Усилилось влияние генетической инженерии на технологию тех лекарственных веществ, которые уже давно создаются по био- логической технологии. Еще в 40-50-е гг. XX в. была создана

биологическая промышленность для производства антибиотиков, которые составляют наиболее эффективную часть лекарственного арсенала современной медицины. Однако в последние годы отмечается значительный рост лекарственной устойчивости бактерий, особенно к антибиотикам. Причина заключается в широком распространении в микробном мире плазмид, детерминирующих лекарственную устойчивость бактерий. Именно поэтому многие знаменитые ранее антибиотики утратили свою былую эффективность. Единственный пока путь преодоления резистентности бактерий к антибиотикам - это поиски новых антибиотиков. По оценкам специалистов, в мире ежегодно создают около 300 новых антибиотиков. Однако большинство из них либо неэффективно, либо токсично. В практику же каждый год вводится лишь несколько антибиотиков, что заставляет не только сохранять, но и увеличивать мощность антибиотической промышленности на основе генно-инженерных разработок.

Основные задачи генной инженерии в тех технологиях лекарственных веществ, в которых продуцентами лекарств являются микроорганизмы, определяются необходимостью генно-инженерной реконструкции последних с целью повышения их активности. В то же

время началась реализация идеи создания лекарств в виде малых молекул, что способствует их большей эффективности.

Иммунная биотехнология связана с производством прежде всего вакцин нового поколения для профилактики инфекционных болезней человека и животных. Первыми коммерческими продуктами, созданными с помощью генетической инженерии, стали вакцины против гепатита людей, ящура животных и некоторые другие. Исключительно важное направление в этой области связано с производством моноклональных антител, реагентов, необходимых для диа- гностики возбудителей болезни, а также для очистки гормонов, витаминов, белков различной природы (ферментов, токсинов и др.).

Значительный практический интерес представляет метод получения искусственного гемоглобина путем введения гемоглобиновых генов в растения табака, где под контролем этих генов продуциру- ются α- и β-цепи глобина, которые объединяются в гемоглобин. Синтезируемый в клетках табачных растений гемоглобин полностью функционален (связывает кислород). Клеточная инженерия в применении к человеку связана не только с решением фундаментальных проблем биологии человека, но и с преодолением прежде всего женского бесплодия. Поскольку частота положительных случаев имплантации в матку женщин эмбрионов, полученных in vitro, является небольшой, то получение монозиготных близнецовэмбрионов in vitro также имеет значение, так как увеличиваются возможности повторных имплантаций за счет «запасных» эмбрионов. Особый интерес представляют перспективы использования стволовых клеток в качестве источника замены клеток и тканей в лечении таких болезней, как диабет, повреждения спинного мозга, боли сердца, остиоартриты, болезнь Паркинсона. Но для реализации этих перспектив необходимо углубленное изучение биологии стволовых клеток.

В использовании генетической инженерии применительно к проблемам медицины особое значение приобрела задача разработки генно-инженерных методов радикального лечения наследственных болезней, которые, к сожалению, еще не поддаются лечению существующими методами. Содержание этой задачи заключается в разработке способов исправления (нормализации) мутаций, результатом которых являются наследственные болезни, и в обеспечении передачи «исправлений» по наследству. Считают, что успешной разработке генно-инженерных методов лечения наследственных болезней будут

способствовать данные о геноме человека, полученные в результате выполнения международной научной программы «Геном человека».

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Подняв на новый уровень биотехнологию, генетическая инженерия нашла также применение в разработке способов определения и устранения загрязнений окружающей среды. В частности, сконструированы штаммы бактерий, которые являются своеобразными индикаторами мутагенной активности химических загрязнений. С другой стороны, генно-инженерным способом сконструированы штаммы бактерий, содержащие плазмиды, под контролем которых происходит синтез ферментов, способных разрушать многие химические соединения- загрязнители среды обитания. В частности, некоторые плазмидосодержащие бактерии способны разлагать до безвредных соединений нефть и нефтепродукты, оказавшиеся в среде в результате различных аварий или других неблагоприятных причин.

Однако генетическая инженерия - это превращение генетического материала, которое в природе отсутствует. Следовательно, продукты генной инженерии - это абсолютно новые продукты, не существующие в природе. Поэтому она сама по себе из-за неизвестности ее продуктов таит опасность как для природы и среды обитания, так и для персонала, работающего в лабораториях, где используют методы генетической инженерии или работают со структурами, созданными в ходе генно-инженерных работ.

Поскольку возможности клонирования генов безграничны, то еще в самом начале этих исследований среди ученых возникли вопросы о природе создаваемых организмов. Одновременно были высказаны предположения о ряде нежелательных последствий этой методологии, причем эти предположения нашли поддержку и среди широкой общественности. В частности, появились раз- ногласия о свойствах бактерий, получивших в генно-инженерных экспериментах гены животных. Например, сохраняют ли бактерии Е. coli свою видовую принадлежность из-за содержания введенных в них генов животного происхождения (например, гена инсулина) или их следует считать новым видом? Далее, насколько долговечны такие бактерии, в каких экологических нишах они могут

существовать? Но самое главное стало заключаться в появлении опасений, что в ходе производства и манипуляций с рекомбинантными молекулами ДНК могут быть созданы генетические структуры со свойствами, непредвиденными и опасными для здоровья человека, для исторически сложившегося экологического равновесия. Тогда же начались и призывы к мораторию на генетическую инженерию. Эти призывы вызвали международный резонанс и привели к международной конференции, которая состоялась в 1975 г. в США и на которой широко обсуждались возможные последствия исследований в этой области. Затем в странах, где стала развиваться генетическая инженерия, были выработаны правила работы с рекомбинантными молекулами ДНК. Эти правила направлены на исключение попадания в среду обитания продуктов деятельности генно-инженерных лабораторий.

Другой аспект нежелательных последствий генно-инженерных работ связан с опасностью для здоровья персонала, работающего в лабораториях, где применяют методы генетической инженерии, поскольку в таких лабораториях используют фенол, этидий бромид, УФ-излучения, которые являются вредными для здоровья факторами. Кроме того, в этих лабораториях существует возможность заражения бактериями, содержащими рекомбинантные молекулы ДНК, контролирующие нежелательные свойства, например лекарственную резистентность бактерий. Эти и другие моменты определяют необходимость повышения уровня техники безопасности в генноинженерных работах.

Наконец, широко обсуждаются в обществе проблемы опасности генетически модифицированных продуктов (генетически изме- ненных томатов, картофеля, кукурузы, сои), а также таких продуктов, как хлеб, пасты, конфеты, мороженое, сыр, растительное масло, мясные продукты, которые в ряде стран, особенно в США, приобрели широкое распространение. На протяжении 12 000 лет сельского хозяйства человек употреблял продукты естественного происхождения. Поэтому предполагают, что с генетически модифицированной пищей в организм человека попадут новые токсины, аллергены, бактерии, канцерогены, что приведет к совершенно новым болезням будущих поколений. В связи с этим возникает вопрос о подлинно научной оценке генетически модифицированной пищи.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ

1. Что понимают под генной, клеточной и генетической инженерией? Есть ли разница между этими понятиями и молекулярном клонировании?

2. В чем заключается прогрессивность генетической инженерии по сравнению с другими методами, используемыми в биологии?

3. Перечислите основные «инструменты» генной инженерии.

4. Что представляют собой ферменты-рестриктазы, каковы их свойства и их роль в генной инженерии?

5. Все ли рестриктазы образуют «липкие» концы исследуемых ДНК и зависит ли структура «липких» концов от вида рестриктазы?

6. Дайте определение генетическим векторам. Существуют ли природные векторы?

7. Как получают генетические векторы в лабораторных условиях? Какие биологические объекты являются исходным материалом для получения векторов?

8. Какова предельная длина последовательностей азотистых оснований ДНК, которые еще могут включиться в генетический вектор? Различаются ли векторы по «мощности»?

9. Охарактеризуйте свойства ДНК-лигазы и определите ее роль в генной инженерии.

10. Как смыкают клонируемый сегмент ДНК (ген) с генетическим вектором?

11. Какова частота введения рекомбинантных молекул ДНК в бактериальные клетки?

12. На каком принципе основана селекция бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК? Приведите один из примеров такой селекции.

14. Многие штаммы бактерий обладают одинаковыми ферментами, практически одинаково обеспечивающими их метаболизм. Между тем нуклеотидная специфичность систем рестрикции-модификации бактерий различна. Можете ли вы объяснить это явление?

15. Почему последовательности ДНК, представляющие сайты распознавания рестриктазами, не могут содержать более восьми пар оснований?

16. Сколько раз последовательность ГГЦЦ, распознаваемая рестриктазой Нае III, будет встречаться в сегменте ДНК длиной в 50 000 пар оснований с 30-, 50- и 70-процентным содержанием ГЦ?

17. Рестриктазы Bam HI и Bgl I плавят последовательности Г ГАТЦЦ и Т ГАТЦА соответственно. Можно ли включить в сайт Bam HI фрагменты ДНК, продуцированные Bgl I-рестрикцией? Если да, то почему? Если используемая плазмида (вектор) содержит один сайт для рестрикции Bgl I, то на какой питательной среде можно осуществить селекцию бактерий, эту плазмиду?

18. Вычислите частоту трансформации бактерий на одну молекулу ДНК, если на 5000 плазмидных пар оснований образуется 5-10 5 трансформантов?

19. Можно ли клонировать 0-пункт репликации ДНК Е. coli и если да, то каким образом?

20. Можно ли определить, сколько необходимо молекул ДНК для трансформации одной клетки Е. coli?

21. Можно ли с помощью полимеразной цепной реакции определить сайт сплайсинга на мРНК?

22. Каким образом можно использовать полимеразную цепную реакцию для того, чтобы ввести желаемый сайт рестрикции в интересующее место на фрагменте ДНК, предназначенном для клонирования?

23. Назовите методы клеточной инженерии в применении к животным. Какова хозяйственная ценность животных, получаемых этими методами?

24. Дайте определение понятиям «трансгенные растения» и «трансгенные животные». Сохраняют ли трансгенные организмы свою видовую принадлежность или их можно считать организмами новых видов?

25. Что такое гибридомы и моноклональные антитела? Как их получают?

26. Применима ли клеточная инженерия к человеку?

27. Допустим, что инъекция чужеродной ДНК в яйцеклетку мыши и имплантация оплодотворенной таким путем яйцеклетки в организм мыши закончились ее беременностью и рождением мышат, содержащих в геноме копии инъецированной ДНК. Однако мышата оказались мозаиками, т.е. одни их клетки содержат копии инъецированной ДНК, другие лишены этой ДНК. Можете ли вы объяснить природу этого явления?

28. Считаете ли вы генетически опасной пищу, приготовленную из генетически измененных продуктов?

29. Необходима ли научная экспертиза генетически измененных продуктов питания?

Познание определяется тем, что утверждается нами как Истина.

П.А. Флоренский, 1923

Главная » Английский алфавит » Генная инженерия позволяет получить все кроме. Генная инженерия