Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителяэозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержатнуклеиновые кислоты (ДНК иРНК ):клеточное ядро ,рибосомы и РНК-богатые участкицитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточныебелки , например,тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой.Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

2. Окраска железным гематоксилином

Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибрoтомных, изготовленных на заморажи-вающем микротоме) и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Предназначен для использования в качестве ядерного красителя при окраске соединительной ткани по Ван-Гизону, Маллори, Массону и в других многоцветных методах окраски гистологических препаратов. Достоинствами предлагаемого гематоксилина являются отличное и интенсивное окрашивание ядер клеток в срезах, устойчивость окраски к пикриновой Кислоте и другим слабым кислотам, отсутствие тенденции к перекраске препарата(при соблюдении рекомендаций) и необходимости дифференцировки окраски.

3. Окраска метиленовым синим Лефлера Методика окраски. Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго. Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Органический основной тиазиновый краситель , применяют для окраскихлопка ,шерсти ,шелка в ярко-голубой цвет, однако окраска слабоустойчива на свету. Ваналитической химии применяется для определенияхлоратов ,перхлоратов ,катионов ртути ,олова ,магния ,кальция ,кобальта ,кадмия .

В медицине используется в качествеантисептика ,антидот при отравлениицианидами ,угарным газом исероводородом . Имеются сообщения о высокой эффективности этого соединения при леченииболезни Альцгеймера .

4. Окраска пикрофуксином

При окраске пикрофуксином набухшие коллагеновые пучки ярко-красного цвета, гомогенные с плохо различимым волокнистым строением. В очагах более резкого поражения коллагеновые пучки неравномерной окраски, местами они ярко-красные, местами с пятнами желтого цвета, местами коричневые. 5. Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии. Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде. Методика окраски 1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии. Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный.

6. Окрашивание конго-красным

Внешний вид - красно-коричневые кристаллы. плохо растворим в холодной воде. В органических растворителях не растворяется.Данный краситель находит применение в микроскопических исследованиях и используется, в виде спиртового, водного или аммиачного раствора для окрашивания клеточной оболочкигрибов (самостоятельно, либо в сочетании сгенциановым фиолетовым ) . Конго красный широко применяется в гистологии для выявления амилоида . Помимо этого "классического" применения, конго красный используется в десятках других процедур окрашивания в зоологии беспозвоночных, ботанических исследованиях, цитологии человека и животных .

библиографическое описание:
Замечания по технике окрашивания — .

код для вставки на форум:
Замечания по технике окрашивания — .

wiki:
— .

При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми - из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом.

Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно.

Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату.

1. ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тионин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г.

Гематоксилин и способы его приготовления

Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина - гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созрева­ния - окисления, на которое требуется от 10 дней до 2-3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

Гематоксилин Эрлиха

1. Гематоксилин кристаллический 2г

2. Спирт 96% 100мл

3. Дистиллированная вода 100 мл

4. Глицерин 100 мл

5. Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3г

6. Ледяная уксусная кислота 10 мл

Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы - в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10-14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4-6 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Для приготовления солянокислого спирта к 100мл-70% спирта добавляют 1мл концентрированной соляной кислоты. Для приготовления аммиачной воды к 50мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака.

Результат: ядра клеток тёмно-синие(оболочка, хроматин), ядерный матрикс бледно-голубой или прозрачный.

Гематоксилин Делафильда

1. Гематоксилин кристаллический 4гр

2. Спирт 96% 25мл

3. Алюмокалиевые или алюмоаммониевые квасцы 40гр

4. Дистиллированная вода 400мл

Приготовление: спирт+гематоксилин+квасцы=3-4дня на свету, перемешывая,фильтруют+100мл глицерина+100мл метилового спирта=3-4 дня на свету, фильтруют. Перед применением разбавляют в 2 раза дистиллированной водой или 2% раствором алюмокалиевых квасцов.Окрашывание 4-6 минут, промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, восстановление в амиачной воде, промывание в ДВ.В результате хроматин и кариолемма ярко-синие.

Гематоксилин Гарриса

1. Кристалическый гематоксилин 5 гр + спирт 50мл-96%

2. Алюмоамонийные квасцы 100гр+ ДВ 1литр

3. Смешывают + 60мл глицерина + 2,5 оксида ртути. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Перед использованием до 100мл раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. Окраска 3-4 минуты, дает чёткие ярко-синие ядра.

Гематоксилин Гарриса в модификации Кисели

Исключил квасцы.

1. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-96%

2. Кристалический гематоксилин 20гр + ДВ 200мл

3. Смешивают, доводят до кипения, + 500мг желтого оксида ртути. Остужают, фильтруют, готов к использованию. Окраска 4-6 минут, дает ярко-синие ядра.

Гематоксилин Ганзена

4. Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-100%

5. Алюмокалиевые квасцы 20гр+ ДВ 100мл

6. Смешывают + 3мл насыщеного раствора перманганата калия. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Окраска 3-4 минуты, дает красно-фиолетовые ядра.

Гематоксилин Маллори(водный)

Кристалическый гематоксилин 2,5 гр + алюмоамонийные квасцы 50гр+ ДВ 1литр

Выдержывают 10 суток при 25С, +440мг перманганата калия и 2,5гр тимола, перемешивают,

фильтруют. Синие ядра.

Кислый гемалаун Майера(водный)

1. Кристалический гематоксилин 1 гр

2. Алюмоамонийные квасцы 50гр

3. ДВ 1литр

4. Йодат натрия 200мг

5. Хлоралгидрат 50гр

6. Лимонная кислота 1 гр

Квасцы растворяют в воде без нагревания, затем добавляют и растворяют гематоксилин, йодат натрия, лимонную кислоту и последним - хлоралгидрат. После растворения всех компонентов краску фильтруют, и она готова к применению.

Продолжительность окрашивания 4-6 мин.

Результат: ядра красно-фиолетовые.

Гематоксилин Кораци (водный)

1. Гематоксилин кристаллический 0,1 г

2. Йодат калия 2-3 кристал

3. Алюмокалиевые квасцы 5 г

4. Дистиллированная вода (теплая) 100 мл

Смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 25 мл глицерина. Раствор перед использованием фильтруют. Продолжительность окрашивания 1-2 мин. Результат: ядра ярко-синие.

Железный гематоксилин Гейденгайна

1. Гематоксилин кристаллический 1 г

2. Спирт 96 % 10мл

3. Дистиллированная вода 90 мл

Краситель созревает 4 нед. Добавление 100 мг йодата натрия ускоряет «созревание» - он готов к использованию уже через 1 ч после приготовления. Окрашивание проводят разведенным в 2 раза раствором.

Продолжительность окрашивания 1 -36 ч.

Методика окрашивания

1. Препарат помещают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2-12 ч.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде.

3. Окрашивают гематоксилином Гейденгайна 1-36 ч.

4. Промывают в водопроводной воде - 3 смены по 10 мин, затем обезвоживают, просветляют, заключают.

Результат: ядра и цитоплазматические структуры черные и синевато-черные.

Железный гематоксилин Брусси

1. Гематоксилин кристаллический 1 г I

2. Дистиллированная вода при 40 "С 100 мл I

3. Железоаммонийные квасцы 8 г II

4. Дистиллированная вода при 40 "С 100 мл II

Растворы I и II смешивают, фильтруют. Продолжительность окрашивания 30 с-1 мин. Затем промывают в водопроводной воде, обезвоживают, просветляют заключают.

Результат: ядра синевато-черные.

Железный гематоксилин Вейгерта

1. Гематоксилин кристаллический 1 г А

2. Спирт 96 % 100мл А

3. Раствор трихлорида железа гексагидрата 50%-4 мл В

4. Дистиллированная вода 95 мл В

5. Концентрированная соляная кислота 1 мл В

Растворы хранят в отдельных склянках с притертыми пробками. Перед использованием нужное для окрашивания количество краски получают путем смешивания растворов А и Б в пропорции 1:1.

Продолжительность окрашивания 1-2 мин, затем промывают в водопроводной воде.

Результат: ядра черно-синие.

Другие ядерные красители

Кармин

• Кармин 1 г
• Дистиллированная вода 100 мл
• Раствор кипятят 15 мин,охлаждают, фильтруют, добавлявляют
• 10 мл 40 % формалина.

Продолжительность окрашивания 30 мин-24 ч. Затем следует промывание в дистиллированной воде, дифференцировать в солянокислом спирте, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра ярко-красные.

Сафранин

Обеспечивает получение хороших результатов после фиксации ткани в тетраоксиде осмия и особенно после применении фиксаторов, содержащих хром.

• Основной раствор:Сафранин-10г + Спирт 96-155мл + Дистилл вода-145мл
• Краситель: -Основной р-р 20мл + Спирт 50%-80мл

Продолжительность окрашивания 24 ч. Затем следуют промывание дистиллированной водой, дифференцировка в солянокислом спирте, дистиллированная вода, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин ядер и кариолемма ярко-красные.

Галлоцианин

• Галлоцианин 100 г
• Хромовые квасцы 5 г
• Дистиллированная вода 100 мл

Сначала растворяют квасцы, затем добавляют Галлоцианин, раствор кипятят при постоянном помешивании, охлаждают, фильтруют. Срок годности красителя 1 мес.

Продолжительность окрашивания 24-48 ч. Затем следуют промывание в 2 сменах дистиллированной воды, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин и тигроидное вещество синевато-черные.

Сок черники

Свежие чистые ягоды черники разминают в фарфоровой ступке, смешивают с равным объемом 96 % спирта, настаивают 1- 2 сут и фильтруют. Перед окрашиванием часть раствора разводят равным количеством 2 % водного раствора алюмокалиевых квасцов и добавляют 2-3 кристаллика тимола.

Продолжительность окрашивания 5-7 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра темно-фиолетовые.

2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ

Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и сульфоновые кислоты, нитро-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин. Чаще используют 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1 % спиртовой раствор.

Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3-5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препарат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах.

Смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты (пикрофуксин) готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого фуксина (см. главу 22).

3. Методика окраски гематоксилином и эозином

Процедура окрашивания срезов, полученных на замораживающем микротоме, после парафиновой или целлоидиновой заливки различается лишь по техническим приемам, а порядок проведения окраски одинаков.

1. Раствор гематоксилина 1-20 мин
2. Дистиллированная вода ополоснуть
3. Солянокислый спирт дифференцировка
4. Аммиачная вода срезы синеют (контроль под микроскопом)
5. Проточная вода 5-10 мин
6. Дистиллированная вода ополоснуть
7. Раствор эозина 10 с-3 мин
8. Спирт 96 %,
9. карбол-ксилол, заключение.

Результат: ядра синие, цитоплазмаи межклеточное веществорозовые.

Кора надпочечника состоит из тяжей эндокриноцитов. В клубочковой зоне мозговые эндокриноциты мелкие, образуют тяжи в виде арок. Наиболее выражена пучковая зона. Клетки этой зоны крупные, содержат значительное количество липидов. Тяжи клеток расположены параллельными пучками, направленными к мозговому веществу надпочечника. В сетчатой зоне коры эпителиальные тяжи переплетаются и идут в различных направлениях, образуя сеть. В этой зоне расположены самые мелкие клетки коркового вещества надпочечника. Прослойки соединительной ткани в коре надпочечника незначительны, многочисленные сосуды, расположенные между эндокриноцитами, имеют вид щелей.

В мозговом веществе надпочечника крупные клетки нервной природы (хромаффиноциты) образуют скопления вокруг синусоидных капилляров. В мозговом веществе расположены крупные венозные синусы.

При малом увеличении микроскопа:

а) найти капсулу. Волокна, расположенные по периферии органа оксифильно окрашены (гем.-эоз.) или серо-черного цвета (железный гем.). В капсуле располагаются вегетативные ганглии, скопления адипоцитов, нервы, сосуды.

б) найти кору и границу между корой и мозговым веществом. В корковом веществе видны цепочки клеток (цитоплазмой розового цвета, ядра - синего при окраске гем.-эоз.,

При окраске железным гем. цитоплазма клеток серая, ядра – черные. В мозговом веществе клетки более крупные, расположены диффузно.

в) найти зоны коры. Под капсулой клетки образуют клубочки; в пучковой зоне – видны тяжи клеток радиально направленных параллельными пучками к мозговому веществу; в сетчатой зоне тяжи клеток переплетаются, образуя сеть.

г) рассмотреть хромаффиноциты мозгового вещества. Эти крупные эндокриноциты расположены рыхлыми скоплениями вокруг синусоидных капилляров.

д) найти венозный синус. В центре мозгового вещества расположена крупная полость – мозговой венозный синус.

Зарисовать препарат и обозначить на рисунке:

1. капсулу

2. корковое вещество

3. корковые эндокриноциты

4. клубочковую зону

5. пучковую зону

6. синусоидные капилляры

7. сетчатую зону

8. мозговое вещество

9. хромаффиноциты

10. венозный синус

Фото. 2.3.1. Надпочечник. Железный гем.

Малое увеличение. (Ув.10х7)

Фото. 2.3.2. Надпочечник. Гем.-Эоз.

Малое увеличение. (Ув.10х7)

Фото. 2.3.3. Клубочковая зона коры надпочечника. Гем.-Эоз.

Большое увеличение. (Ув.40х7)

Фото. 2.3.4. Пучковая зона коры надпочечника. Железный гем.

Большое увеличение. (Ув.20х7)

Фото. 2.3.5. Сетчатая зона коры и мозговое вещество надпочечника. Железный гем.

Страница 47 из 68

Окрашивание гематоксилин-эозином (фиксация любая)

Этот метод самый распространенный в гистологической практике, так как благодаря удачному сочетанию красителей, относящихся к двум противоположным группам, позволяет получить общее представление о состоянии исследуемых органов и тканей.
Гематоксилин - природный краситель растительного происхождения, растворимый в воде, спирте и глицерине*.

* Последнее обстоятельство является противопоказанием к заключению в глицерин срезов, окрашенных гематоксилином.

В растворе гематоксилин обладает основными свойствами, благодаря чему хорошо выявляет структурные компоненты ядра, которые содержат нуклеиновые кислоты. Однако красящим свойством обладает не сам гематоксилин, а продукт его окисления -гематеин.
Эозин - искусственный краситель, растворимый в воде или спиртах, обладает кислотными свойствами, окрашивает цитоплазму клеток в розовый цвет.
Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, но суть их одна - его окисление.
Приводим наиболее распространенные рецепты.
Кислый гематоксилин Эрлиха. В 100 мл 96% спирта растворить 2 г гематоксилина, прибавить 100 мл дистиллированной воды, затем 100 мл чистого глицерина, 3 г калийных квасцов (химически чистых) и 10 мл ледяной уксусной кислоты, взболтать и оставить на свету «созревать» в течение 14 дней, периодически взбалтывая. Для того чтобы обеспечить постоянный доступ воздуха (процесс окисления гематоксилина), следует брать широкогорлый сосуд и накрывать входное отверстие несколькими слоями марли. В процессе «созревания» раствор из светло-красного становится темно-красным. В плотно закрытом сосуде краситель сохраняет свойства длительное время.
Гематоксилин Бемера. В 10 мл 100% спирта растворить 1 г кристаллического гематоксилина и добавить 200 мл 10% водного охлажденного и профильтрованного раствора калийных квасцов. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 дней, после чего им можно пользоваться. Перед употреблением раствор красителя каждый раз фильтруют. Со временем он портится.
Кислый гемалаун Майера. В 1000 мл дистиллированной воды растворить 1 г гематоксилина, добавить 0,2 г йодата натрия (NaIО3), 50 г калийных квасцов (химически чистых) и, непрерывно помешивая, дождаться их полного растворения (при этом жидкость приобретает фиолетово-синюю окраску). Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты, в результате чего раствор становится фиолетово-красным. В хорошо закрытом сосуде из химически чистого стекла краситель хранится длительное время.
Преимущество данного метода - быстрое окисление гематоксилина йодатом натрия, благодаря чему раствор не требует «созревания» и сразу может употребляться для окрашивания.
Приготовление красящего раствора из гематеина: а) 1г фабричного гематеина растворяют в 50 мл 96% спирта (при слабом подогревании); б) 5 г калийных квасцов (химически чистых) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Затем сливают оба раствора, фильтруют и добавляют немного тимола (для консервации). Применяют без «созревания». Раствор хорошо сохраняется в плотно закрытом сосуде.
Приготовление эозина: 0,1 красителя растворяют в 100мл дистиллированной воды.
Перед окрашиванием необходимо подготовить рабочее место, убрать в сторону все лишние предметы, установить микроскоп и освещение к нему, расставить в определенном порядке посуду с соответствующими жидкостями, проверить состояние «батарей» для обезвоживания и просветления препаратов, отфильтровать красящие растворы, подготовить покровные (а если нужно, и предметные) стекла и т. д. Лишь после этого можно приступать к окрашиванию препаратов.
Методика окрашивания. Начинать следует с определения продолжительности, так как она находится в зависимости от способа фиксации, характера и свойств препарата и самих красителей и т. д. Для этого извлекают из дистиллированной воды три стекла со срезами (доведение препаратов до воды - см. предыдущий раздел), удаляют излишки влаги вокруг них (иначе краска растечется по всему стеклу и разбавится водой), кладут в горизонтальном положении и накапывают пипеткой раствор красителя до полного покрытия препарата. Через 2 мин сливают красящий раствор* с одного из стекол и помещают его в дистиллированную воду (для отмывания излишков красителя). Два оставшихся стекла освобождают от гематоксилина через 4-6 мин соответственно. После этого, вытерев тыльную сторону стекла, препарат рассматривают при малом увеличении микроскопа (если нужно, то и при большом, накрыв препарат покровным стеклом). При окраске свободноплавающих срезов с помощью крючочков переносят несколько срезов в краситель, налитый на часовое стекло или в низкий бюкс, а затем через такие же промежутки времени извлекают, промывают в дистиллированной воде, расправляют на чистом предметном стекле и рассматривают в микроскоп.
Возможные варианты результатов: а) ядра окрашены в светло-фиолетовый цвет без четкого различия микроструктур - препарат недокраш е н; б) ядра темно-фиолетовые (почти черные, но с красноватым оттенком), структурные элементы расплывчаты, цитоплазма тоже окрашена - препарат перекрашен; в) ядра красно-фиолетовые с отчетливо выраженными ядрышком и хроматином, цитоплазма светлая, неокрашена - окраска нормальная.

* Краситель сливают в сосуд, откуда его брали, так как он пригоден к дальнейшему употреблению.

Установив оптимальное время окрашивания гематоксилином, в течение 3-5 мин отмывают излишки красителя в дистиллированной воде и затем помещают препараты в водопроводную воду, где они находятся до приобретения синей окраски (10-14 мин) вследствие посинения ядер в слабощелочной среде (водопроводную воду можно заменить дистиллированной, слегка подщелочив ее аммиаком). После этого препарат вновь помещают на 3-5 мин в дистиллированную воду.
Помимо изложенного выше прогрессивного метода окраски ядер гематоксилином, существует регрессивный метод. Срез с перекрашенными ядрами после промывания в дистиллированной воде помещают на 1-6 с в подкисленный 70° спирт (5-7 капель крепкой хлористоводородной кислоты на 100 мл спирта) и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски (ослабевает фиолетовый и усиливается красноватый тон ядер). Дальнейшая обработка обычная.
Окраску ядер гематеином и кислым гемалауном Майера производят таким же способом, но необходимо особенно тщательно промыть препарат, так как неудаленный остаток кислоты может нарушить окраску.
По окончании промывки окрашенного гематоксилином препарата в дистиллированной воде его вновь извлекают, удаляют излишнюю влагу и накапывают раствор эозина. Время окраски также подбирают опытным путем, варьируя экспозицию от 1 до 4-5 мин.
Возможные варианты: а) окрашенная цитоплазма и внеклеточные образования имеют едва заметный розоватый или желтоватый оттенок - препарат недокрашен; б) общий фон интенсивно красного цвета, микроструктуры видны нечетко, граница ядер расплывчата - препарат перекрашен; в) общий фон умеренно розовато-желтого цвета, ядра четко контурируются - окраска удачная.
После того как окрашивание эозином закончено, краситель сливают обратно во флакон (как и гематоксилин, он может употребляться многократно), препарат ополаскивают в дистиллированной воде, проводят через спирты восходящей концентрации, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Следует знать, что эозин легко вымывается в воде и спиртах низкой концентрации, поэтому проводить препарат через эти жидкости следует быстро, лишь окунув несколько раз, и только в 96% и 100% спирте можно держать 1-2 мин. Если препарат перекрашен эозином, то излишнюю окраску следует удалить, увеличив время промывания (в дистиллированной воде) и проведения через слабые спирты.
Для усиления красящих свойств эозина применяют подкисление раствора красителя уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл красителя).
Помимо описанного двойного метода обзорной окраски препаратов, применяются и другие.
Существуют красители, окрашивающие ядра в красный цвет (сафранин, квасцовый кармин), а цитоплазму - в зеленый (световой зеленый), оранжевый (оранжевый Г).

Окрашивание железным гематоксилином по Гейденгайну

(фиксация любая, но наилучшие результаты после сулемовых и хромовых фиксаторов)

Железный гематоксилин в отличие от приведенных выше гематоксилиновых растворов окрашивает не только ядра, но и различные цитоплазматические и некоторые межклеточные структуры. Это свойство основано на том, что перед окрашиванием препарат протравливают в растворе железоаммониевых квасцов, которые по-разному воспринимаются различными тканевыми элементами. Последующая обработка протравленных тканей гематоксилиновым раствором приводит к образованию черного железно-гематеинового лака, который в процессе дифференцировки срезов частично уходит из тканей обратно в раствор. Таким образом, по типу окрашивания железный гематоксилин - типичный регрессивный краситель.
Из сказанного следует, что, варьируя время протравливания, окрашивания и дифференцировки, можно получать различный конечный эффект в зависимости от целей исследования (выявить только ядерные структуры или одновременно цитоплазматические и внеклеточные образования).
Приготовление растворов. 1. Раствор железоаммониевых квасцов. Растворить 10 г железоаммониевых квасцов (сульфат аммиака-железа) в 100мл дистиллированной воды. Можно употреблять только светло-фиолетовые кристаллы. Желтые, зеленоватые, беловатые кристаллы применять не следует.

1. Раствор гематоксилина. Растворить 1 г гематоксилина в 10 мл 96% спирта и разбавить дистиллированной водой до 100 мл, отметив уровень жидкости в сосуде, затем оставить для «созревания» на 4-5 нед, обеспечив постоянный доступ света и воздуха (для этого горлышко сосуда надо прикрыть сложенной в несколько слоев марлей и по мере испарения доливать воду до исходного уровня). В процессе созревания раствор меняет светло-коричневую окраску на темно-коричневую. Перед употреблением раствор разбавляют равным количеством дистиллированной воды.

Если нужно обеспечить быстрое приготовление раствора гематоксилина (без созревания), то к раствору, приготовленному по описанному выше рецепту, добавляют 0,1 г йодата натрия (NaIО3), который быстро окисляет гематоксилин в гематеин и делает краситель пригодным к употреблению через 1 ч после приготовления.
Проведение окрашивания. Предварительная обработка. Находящиеся в дистиллированной воде срезы переносят в 2,5% раствор железоаммониевых квасцов (приготовленный путем разбавления дистиллированной водой исходного 10% раствора) и оставляют на 3-12 ч.
Процесс протравливания можно значительно ускорить (до 1-3 мин), поместив сосуд со срезами в термостат при 37°С. По окончании протравливания раствор сохраняют.
Окрашивание. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы помещают в разбавленный (вдвое) раствор гематоксилина на 1-36 ч, до полного почернения (лучше перекрасить, чем недокрасить). Как и при протравливании, время окраски можно сократить (до 2-3 ч - 30 мин) путем помещения сосуда с красящимися срезами в термостат при 37°С.
Дифференцировка. Это самый ответственный этап окрашивания. Окрашенные срезы тщательно отмывают в двух-трех порциях дистиллированной воды (7- 10 мин) и помещают в раствор железоаммониевых квасцов, служивший для протравливания. Степень дифференцировки периодически контролируют в микроскоп. Для этого срез ополаскивают в дистиллированной воде и рассматривают при нужном увеличении (вплоть до водной иммерсии, накрыв предварительно покровным стеклом). Если процесс дифференцировки идет быстро, то следует уменьшить концентрацию раствора железоаммониевых квасцов, разбавив его дистиллированной водой.
Получив окраску нужной степени, срезы тщательно промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде в течение 10-12 мин (недостаточное отмывание дифференцирующей жидкости приводит к обесцвечиванию препаратов), затем ополаскивают в дистиллированной воде, обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.

Быстрый метод окрашивания железным гематоксилином по Гурвичу

В случае необходимости срочного окрашивания срезов железным гематоксилином Гейденгайна применяют у скоренный метод Гурвича (реактивы те же).
Вынув стекло со срезами из дистиллированной воды, промокают срез гладкой фильтровальной бумагой и покрывают 2,5% раствором железоаммониевых квасцов. Затем тыльную сторону стекла подогревают над спиртовкой до образования пара (не перегревать!) и, дав немного остыть, повторяют процедуру нагревания еще 2-3 раза. После этого сливают квасцы, не промывая срез, накапывают гематоксилин и вновь подогревают до появления паров. Окраску ведут до тех пор, пока срез не приобретает сине-черный цвет. Затем его промывают в дистиллированной воде, заливают квасцами и следят за ходом дифференцировки в микроскоп. По окончании дифференцировки срез тщательно отмывают от квасцов (в двух-трех сменах дистиллированной воды, а затем в проточной), обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам. При работе со свободноплавающими срезами рекомендуется предварительно наклеить их на предметное стекло сразу же по извлечении из воды и вести окраску, как описано. Обработка срезов в свободноплавающем состоянии может дать неравномерную окраску.
Общие замечания. Приведенное выше описание протравливания, окраски и дифференцировки зависит от многих факторов (качество реактивов, свойство изучаемого объекта, цели и задачи исследования и т. д.) и устанавливается опытным путем в каждом конкретном случае. Наиболее ответственным этапом окрашивания является дифференцировка, так как отдельные структурные компоненты клеток и тканей с различной скоростью отдают обратно накопленный краситель. Быстрее всех обесцвечивается гомогенная часть цитоплазмы, затем ее гранулярные компоненты и в последнюю очередь структурные элементы ядра.
При работе с целлоидиновыми срезами следует предварительно освободить препарат от целлоидина (см. соответствующий раздел), так как он значительно подкрашивается железным гематоксилином и не обесцвечивается при дифференцировке. Растворение целлоидина следует производить до протравливания в железоаммониевых квасцах, так как после него растворимость значительно ухудшается.

Этикетирование предметных стекол

После наклейки срезов (или непосредственно перед ней) на предметное стекло необходимо нанести соответствующие обозначения. Особенно это важно при серийных срезах и при обработке экспериментального материала. Конкретное содержание пометок зависит от характера исследования и от установок, принятых в той или иной лаборатории. Наиболее надежный способ - выцарапывание знаков специальными карандашами с наконечниками из твердых сплавов типа «победит». Менее надежны надписи тушью. Существуют различные приемы, чтобы тушь при обработке в жидких средах не смывалась и не размазывалась: а) до наклеивания срезов один из концов предметного стекла, смазанный белком с глицерином, нагревают над огнем до появления дыма, после охлаждения наносят на данный участок необходимые обозначения и снова прогревают над пламенем; б) наносят соответствующую надпись, а затем опускают эту часть стекла в 1-2% раствор целлоидина для образования защитной пленки и т. д.

Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г.-э)

1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стёкла, освобождают от парафина (депарафинизируют) поочерёдно погружая их в 2 Порции ксилола (толуола, бензола) – По 3 мин.

2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации (96º, 80º, 60º, 40º, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин .

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затеи всполаскивают в дистиллированной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации – поочерёдно в спирты 40º, 60º, 80º, 96º, и 100º – По 1-2 мин.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола – по 2 мин .

9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стремясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой грузик для удаления избытка бальзама (полистирола).

Оценка результатов окрашивания

Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называются Базофильными (от лат. Basis – основание). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут тёмно-синими или тёмно-фиолетовыми.

Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Поэтому окрашивающиеся им щелочные компоненты клеток или неклеточных структур называются Оксифильными, Или ацидофильными (от греч. Oxy Или лат. Acidum – кислота), Или эозинофильными .

Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, активно синтезирующие белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается Базофильно . Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и основными, и кислыми красителями, то они называются Нейтрофильными , или Гетерофильными .

Есть целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на им несвойственный (синий на красный или фиолетовый; чёрный на жёлтый или зелёный и т. д.). Такое явление получило название Метахромазия.

При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты Могут сохраняться десятилетиями, не утрачивая своих первоначальных качеств.

Следует помнить , что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана Количественная цито - И гистохимия.

Главная » Полезно знать » Окраска срезов гематоксилин эозином. Электронно-микроскопические методы исследования гистологических препаратов