Гистология (от греческого histes – ткань и logos – учение) в переводе означает «наука о тканях». Однако такое определение суживает объем этой науки, поскольку метод гистологии изучает не только ткани, но и клетки и тонкое строение органов. Кроме того, в задачу гистологии входит выяснение эволюции клеток и тканей, становление и развитие их в организме, изучение функций клеток, тканей, органов и межклеточного вещества, в изучении регенерации тканей, обеспечивающих структурную и функциональную их целостность.

В связи с этим, гистологию принято делить на три раздела: цитологию, общую гистологию и частную гистологию (микроскопическую анатомию). Как вы уже знаете, цитология – это наука о клетке – элементарной единице строения, функционирования и происхождения живой материи. В задачу общей гистологии входит изучение строения, развития, функционирования и происхождения тканей. Частная гистология – это учение о микроскопическом и ультро3микроскопическом строении органов. Следует отметить, что выше указанное деление гистологии на разделы искусственно, поскольку клетки формируют ткани, ткани входят в состав органов, а органы формирую организм.

Следовательно, клетки, ткани и органы части целого организма. Целостностью обладает только организм в его единстве с внешней средой, а клетки, ткани и органы имеют подчиненное значение. Тем не менее с делением гистологии на разделы приходится мириться. Оно необходимо, в первую очередь, для удобства изложения материала. Кроме того, каждый из разделов призван решать определенный круг проблем.

Гистология не может развиваться без тесной связи с другими биологическими дисциплинами: анатомией, физиологией, генетикой, и т.д. Кроме того, гистология связана и с химией, физикой, поскольку в гистологических исследованиях все чаще применяются физико-химические методы исследования, различные химические вещества (фиксаторы, красители) и физические приборы (микроскопы, микротомы и т.д.).

Основным методом исследования гистологии является микроскопический, который заключается в специальной подготовке объектов и рассматривании их под микроскопом. Подготовка заключается в фиксации и окрашивании объекта тем или иным красителем и изготовлении тонких срезов с последующим изучением их в микроскопе. Изучать тонкое строение гистологических объектов можно и на живых препаратах. Однако изучение объекта в живом состоянии весьма затруднительно. Во-первых гистологические структуры в проходящем свете бесцветны и почти не различимы в микроскопе, во-вторых изучению их в микроскопе препятствуют большие размеры. Все это обусловливает необходимость исследования фиксированных объектов, т.е. мертвых клеток, обработанных разными веществами, которые сохраняют ее строение и химический состав. Каждый из этих способов имеет свои преимущества и недостатки, что указывает на необходимость применения их обоих, как дополняющих друг друга.

Современная техника открывает широкие возможности для исследования гистологических структур в живом виде. На живых объектах изучаются физические свойства и химический состав клеток. При помощи микроманипулятора можно проводить различные операции на клетках (удаление внутриклеточных структур, пересадка ядра из одной клетки в другую и т.д.).

1. Методы исследования в гистологии .

Как любая наука гистология располагает своим арсеналом методов исследований:

I. Основной метод - микроскопирование.

А. Световая микроскопия - исследования обычным световым мик-пом.

Б. Спец-ые методы микроскопирования:

Фазовоконтрастный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

Темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

Люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

Ультрафиолетовый мик-п (повышает разрешающую способность м-па)

Поляризационный мик-п(для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т.д.)

Интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в

клетках, определение толщины обьектов)

В. Электронная микроскопия:

Трансмиционная (изучение обьектов на просвет)

Сканирующий (изучение поверхности обьектов)

II. Специальные (немикроскопические) методы:

1.Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа.

2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т.д.

3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат.

4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов.

5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.

6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т.д.)

6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма.

7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности.

8. Экспериментальный метод.

9. Метод трансплантации тканей и органов.

2. В своих исследованиях эмбриология использует ряд методов: описательный, экспериментальный и сравнительно-морфологический.

Описательный метод состоит в наблюдении изменений, происходящих при развитии особи. Описание их было необходимо предпосылкой возникновения экспериментального и сравнительно-морфологического методов.Сравнительно-морфологический метод состоит в сопоставлении эмбриональных стадий разных животных. С его помощью устанавливается сходство между этапами развития различных видов животных, чем значительно расширяет значение описательного метода.

Экспериментальный метод - раздел эмбриологии, изучающий процесс эмбриогенеза в различных экспериментальных условиях с целью поиска путей и методов целенаправленного воздействия на него. Применение экспериментальных методов исследования позволяет установить причины нарушения нормального индивидуального развития, выявить условия, определяющие нормальное развитие организма, а также активно вмешиваться в этот процесс. заключается в изучении развития особи в искусственно измененных условиях или в условиях нарушения типичных соотношений между ее частями. Последнее осуществляется путем пересадок (трансплантации) зачатков органов в необычные для них области зародыша. Экспериментальное исследование открывает широкие возможности для направленного изменения формообразовательных процессов в интересах человека. В экспериментальной эмбриологии применяются различные методы: такие как разделение зародыша на части и прослеживание дальнейшего развития этих частей, пересадка частей одного зародыша другому, изменение хим. состава среды, в которой происходит развитие, метод маркировки (метки) частей зародыша безвредными красителями и др. Метод культивирования тканей и зачатков органов вне организма позволяет раскрыть не только механизмы цитодифференцировки и взаимодействия клеток и тканей в процессе развития, но и оценить прямое действие тех или иных агентов, в т. ч. лекарственных средств, на развивающиеся структуры. С помощью экспериментальной эмбриологии разработаны методы хранения (замораживания) спермы и яйцеклеток, пересадка эмбрионов. Новейшим достижением экспериментальной эмбриологии явилась разработка метода экстракорпорального оплодотворения. Пересадка зародышей, зачатых в пробирке, в матку составляет основу лечения бесплодия.

Соответственно применяемым методам исследования эмбриологию разделяют на описательную, сравнительно-описательную и экспериментальную.

3. Вклад отечественных ученых в развитие гистологии

Началом развития русской гистологии надо считать 30-ые годы 19 века, когда гистология преподавалась на кафедрах анатомии и физиологии. В 60 гг 19 в гистология выделилась в отдельные кафедры. Первая кафедра гистологии создавалась в МГУ - зав.каф. А.И.Бабухин. Школа Бабухина занималась вопросами гистогенеза и гистофизиологии мышечной и нервной ткани.

Почти параллельно открылась кафедра гистологии в Питербургской Медико-хирургической академии. К этой школе относятся К.Э.Бэр - эмбриолог, НМ Якубович - заслуги при изучении ЦНС, МД Лавдовский - автор первого учебника по гистологии.

Ковалевский АО - один из основоположников сравнительной эмбриологии, экспериментальной и эволюционной гистологии; установил единый план развития многоклеточных; обосновал теорию зародышевых листков, как образований лежащих в основе единства развития всех млекопитающих.

Основатель кафедры гистологии в Киевском универ-те - ПИ Перемежко (1968). Киевская школа достигла успехов при изучении развития зародышевых листков, закладки и развития многих органов.

Родоначальник Казанской школы - ИА Арнштейн - занимались проблемой нейрогистологии.

Говоря о вкладе отечественных исследователей в гистологию в советский период нужно отметить:

1. Академик АА Заварзин - предложил теорию «параллельных рядов в тканевой эволюции» - эволюция тканей у разных типов и классов животных происходит сходно, параллельными рядами, поэтому у разных животных ткани с родственными функциями имеют сходное строение.

2. НГ Хлопин - создал теорию «дивергентной эволюции тканей» - ткани развиваются в эволюции и онтогенезе дивергентно, путем расхождения признаков. Поэтому в каждой из 4-х основных группах тканей предлагается выделить подгруппы или типы тканей по их происхождению, источнику развития.

Кафедра гистологии БГМУ создана в 1934 году под руководством профессора Николая Илларионовича Чурбанова. Сотрудники кафедры занимались изучением нейроэндокринного аппарата пищеварительной системы, разработкой гематологических нормативов для различных возрастных групп населения республики Башкортостан, влиянием производственных факторов на организм матери и плода в системе мать:плод, проблемой регенерации мышечных тканей.

4.Гистология и эмбриология и их связь с медико-биологическими дисциплинами.

Гистология с цитологией и эмбриологией, как и другие биологические науки, решает главную задачу - выяснение источников развития, закономерностей гистогенеза, реактивности и регенерации тканей и в связи с этим - возможность целенаправленного воздействия на них. Среди теоретических положений гистологии важное место занимают клеточная теория, теория зародышевых листков, эволюции тканей, гистогенеза и регенерации.

Современные гистология, цитология и эмбриология вносят существенный вклад в разработку теоретических и прикладных аспектов современной медицины и биологии.

К фундаментальным теоретическим проблемам относятся:

Разработка общей теории гистологии, отражающей эволюционную динамику тканей и закономерности эмбрионального и постнатального гистогенеза;

Изучение гистогенеза как комплекса координированных во времени и пространстве процессов пролиферации, дифференциации, детерминации, интеграции, адаптивной изменчивости, программированной гибели клеток и др.;

Выяснение механизмов тканевой регуляции (нервной, эндокринной, иммунной), а также возрастных изменений тканей;

Изучение закономерностей реактивности и адаптивной изменчивости клеток и тканей при действии неблагоприятных экологических факторов и в экстремальных условиях функционирования и развития, а также при трансплантации;

Разработка проблемы регенерации тканей после повреждающих воздействий и методов тканевой заместительной терапии;

Раскрытие механизмов молекулярно-генетической регуляции клеточной дифференцировки, наследования генетического дефекта развития систем человека, разработка методов генной терапии и трансплантации стволовых эмбриональных клеток;

Выяснение процессов эмбрионального развития человека, критических периодов развития, воспроизводства и причин бесплодия.

Курс гистологии с цитологией и эмбриологией тесно связан с преподаванием других медико-биологических наук - биологии, анатомии, физиологии, биохимии, патологической анатомии, а также клинических дисциплин. Так, раскрытие основных закономерностей структурной организации клеток является основой для изложения вопросов генетики в курсе биологии. С другой стороны, изложение вопросов, касающихся эволюции живой материи, в курсе биологии является необходимой предпосылкой для изучения различных уровней организации живой материи в организме человека. Изучение строения органов в курсе анатомии базируется на данных гистологического анализа. В настоящее время, когда исследования клеточных и тканевых структур ведутся на субклеточном и молекулярном уровнях с применением биохимических, иммуноцитохимических методов, отмечается особенно тесная связь гистологии, цитологии и эмбриологии с биохимией и молекулярной биологией. В преподавании, научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли цито- и гистохимические данные. Знание нормальной структуры клеток, тканей и органов является необходимым условием для понимания механизмов их изменений в патологических условиях, поэтому гистология с цитологией и эмбриологией тесно связана с патологической анатомией и многими клиническими дисциплинами (внутренние болезни, акушерство и гинекология и др.). Таким образом, гистология с цитологией и эмбриологией занимает важное место в системе медицинского образования. Для современной медицины с ее направленностью на предупреждение и раннее выявление патологических процессов в организме знания о структурных основах и закономерностях обеспечения устойчивости и надежности живых систем (в том числе - тканей) особенно важны, поскольку прогрессивное развитие цивилизации неизбежно влечет за собой появление новых факторов, неблагоприятно воздействующих на животные организмы, в том числе и человека.

Гистология – («гистос» греч. – ткань, логис - учение) Это наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей многоклеточных организмов и человека. Невооруженному глазу недоступны объекты, являющиеся предметом этой науки. Поэтому и история гистологии тесно связана с истроией создания таких приборов, которые позволяют изучить мельчайшие предметы, невооруженным глазом. 2

Курс гистологии условно разделен на следующие разделы: n 1. Цитология - наука о клетке. n 2. Эмбриология - наука о развитии, от зарождения до полного формирования организма. n 3. Общая гистология - наука об общих закономерностях, присущих тканям. n 4. Частная гистология - изучает строение, развитие органов и систем.

ЦИТОЛОГИЯ – (греч. κύτος «клетка» и λόγος - «учение» , «наука») n Раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти. 4

ЭМБРИОЛОГИЯ n (от др. -греч. ἔμβρυον - эмбрион, зародыш + -λογία от λόγος - учение) - это наука, изучающая развитие зародыша. 5

История создания клеточной теории 1590 год. Янсен изобрел микроскоп, в котором увеличение обеспечивалось соединением двух линз. 1665 год. Роберт Гук впервые употребил термин клетка. 1650 -1700 годы. Антони ван Левенгук впервые описал бактерии и другие микроорганизмы. 1700 -1800 годы. Опубликовано много новых описаний и рисунков различных тканей, преимущественно растительных. 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих. 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. 1838 -1839 годы. Ботаник Матиас Шлейден и зоолог Теодор Шванн объединили идеи разных ученых и сформулировали клеточную теорию, которая постулировала, что основной единицей структуры и функции в живых организмах является клетка. 1855 год. Рудольф Вирхов показал, что все клетки образуются в результате клеточных делений.

История создания клеточной теории 1665 год. Рассматривая под микроскопом срез пробки, английский ученый, физик Роберт Гук обнаружил, что она состоит из ячеек, разделенных перегородками. Эти ячейки он назвал "клетками"

История создания клеточной теории В XVII столетии Левенгук сконструировал микроскоп и открыл людям дверь в микромир. Перед глазами изумленных исследователей замелькали разнообразнейшие инфузории, коловратки и прочая мельчайшая живность. Оказалось, что они повсюду – эти мельчайшие организмы: в воде, навозе, в воздухе и пыли, в земле и водосточных желобах, в гниющих отходах животного и растительного происхождения.

История создания клеточной теории 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. В 1838 г. немецкий ботаник М. Шлейден привлек внимание к ядру, считал его образователем клетки. По Шлейдену, из зернистой субстанции конденсируется ядрышко, вокруг которого формируется ядро, а вокруг ядра - клетка, причём ядро в процессе образования клетки может исчезать.

История создания клеточной теории Немецкий зоолог Т. Шванн показал, что из клеток состоят и ткани животных. Он создал теорию, утверждающую, что клетки, содержащие ядра, представляют собой структурную и функциональную основу всех живых существ. Клеточная теория строения была сформулирована и опубликована Т. Шванном в 1839 г. Суть её можно выразить в следующих положениях: 1. Клетка – элементарная структурная единица строения всех живых существ; 2. Клетки растений и животных самостоятельны, гомологичны другу по происхождению и структуре. Каждая клетка функционирует независимо от других, но вместе со всеми. 3. Все клетки возникают из бесструктурного межклеточного вещества. (Ошибка!) 4. Жизнедеятельность клетки определяется оболочкой. (Ошибка!)

История создания клеточной теории В 1855 г. немецкий врач Р. Вирхов сделал обобщение: клетка может возникнуть только из предшествующей клетки. Это привело к осознанию того факта, что рост и развитие организмов связаны с делением клеток и их дальнейшей дифференцировкой, приводящей к образованию тканей и органов.

История создания клеточной теории Карл Бэр Еще в 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих, доказал, что развитие млекопитающих начинается с оплодотворенной яйцеклетки. Значит развитие любого организма начинается с одной оплодотворенной яйцеклетки, клетка является единицей развития.

История создания клеточной теории 1865 г. Опубликованы законы наследственности (Г. Мендель). 1868 г. Открыты нуклеиновые кислоты (Ф. Мишер) 1873 г. Открыты хромосомы (Ф. Шнейдер) 1874 г. Открыт митоз у растительных клеток (И. Д. Чистяков) 1878 г. Открыто митотическое деление животных клеток (В. Флеминг, П. И. Перемежко) 1879 г. Флеминг – поведение хромосом во время деления. 1882 г. Открыт мейоз у животных клеток (В. Флеминг) 1883 г. Показано, что в половых клетках число хромосом в два раза меньше, чем в соматических (Э. Ван Бенеден) 1887 г. Открыт мейоз у растительных клеток (Э. Страсбургер) 1898 г. Гольджи открыл сетчатый аппарат клетки, аппарат Гольджи. 1914 г. Сформулирована хромосомная теория наследственности (Т. Морган). 1924 г. Опубликована естественно-научная теория происхождения жизни на Земле (А. И. Опарин). 1953 г. Сформулированы представления о структуре ДНК и создана ее модель (Д. Уотсон и Ф. Крик). 1961 г. Определены природа и свойства генетического кода (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Беннер).

Основные положения современной клеточной теории 1. Клетка - элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития организмов. 2. Клетки всех живых организмов гомологичны, едины по строению и происхождению. 3. Образование клеток. Новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток. 4. Клетка и организм. Клетка может быть самостоятельным организмом (прокариоты и одноклеточные эукариоты). Все многоклеточные организмы состоят из клеток. 5. Функции клеток. В клетках осуществляются: обмен веществ, раздражимость и возбудимость, движение, размножение и дифференцировка. 6. Эволюция клетки. Клеточная организация возникла на заре жизни и прошла длительный путь эволюционного развития от безъядерных форм (прокариот) к ядерным (эукариотам).

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 1. Световая микроскопия. 2. Ультрафиолетовая микроскопия. 3. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. 4. Фазово-контрастная микроскопия. 5. Микроскопия в темном поле. 6. Интерференционная микроскопия 7. Поляризационная микроскопия. 8. Электронная микроскопия. 17

Микроскоп n Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубусодержатель. 18

Специальые методы микроскопирования: - фазовоконтрастный микроскоп - (для изуч. живых неокраш-х обьектов)- микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. - темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов). Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. 19

Специальые методы микроскопирования люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов) микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. -ультрафиолетовый способность м-па) мик-п (повышает разрешающую -поляризационный мик-п (для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т. д.) микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы). 20

Специальые методы микроскопирования -интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в клетках, определение толщины обьектов) - микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом. В. Электронная микроскопия: -трансмиционная (изучение обьектов на просвет) -сканирующий (изучение поверхности обьектов) Теоретически разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0, 002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0, 1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм. 21

Специальые методы микроскопирования Просвечивающий электронный микроскоп состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки. Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изображения поверхности исследуемого объекта. Метод сколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. 22

Специальные (немикроскопические) методы: 1. Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа. 2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т. д. 3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат. 4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов. 24 5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.

Специальные (немикроскопические) методы 6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т. д.) 6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма. 7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности. 8. Экспериментальный метод. 9. Метод трансплантации тканей и органов. 25

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания. 32

Фиксирующая жидкость формалин, спирты, глутаральдегид - Наиболее распространённые фиксаторы; Криофиксация - Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (– 196 °С); Лиофилизация – небольшие кусочки ткани подвергаются быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Обезвоживание- стандартная процедура удаления воды-обезвоживание в спиртах, возрастающей крепости (от 70 до 60%). Заливка – делает ткань прочной, предотвращает её раздаваливание и сминание при резании, дает возможность получать срезы стандартной толщины. Наиболее распространенная среда для заливки – парафин. Используют также – целлоидин, пластически среды и смолы. 33

Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов – водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды – обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости. 34

Заливка – необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки – парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы. 35

Ротационный микротом. 40 n Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования.

Методы окраски гистосрезов: n Ядерные (основные): n гематоксилин – окрашивает n n n n ядра в синий цвет; железный гематоксилин; азур II (в фиолетовый); кармин (в красный); сафранин (в красный); метиловый синий (в синий); толуидиновый (в синий); тиониновый (в синий). n Цитоплазматические- (кислые): n эозин – в розовый; n эритрозин; n оранжевый «G» ; n кислый фуксин –в красный; n пикриновая кислота - в желтый; n конго –красный – в красный 44

СПЕЦИАЛЬНЫЕ Методы окраски гистосрезов n Судан III –окраска липидов и жиров в оранжевый цвет; n осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет; n орсеин -окраска эластических волокон в коричневый цвет; n азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темнокоричневый цвет. 45

Структуры клеток: n ОКСИФИЛИЯn способность окрашиваться кислыми красителями в розовый цвет n Базофилияn способность окрашиваться основными красителями в синий цвет n Нейтрофилия – n способность окрашиваться кислыми и основными красителями в фиолетовый цвет. 47

1

Клетка n - это элементарная живая система, состоящая из цитоплазмы, ядра, оболочки и являющаяся основой развития, строения и жизнедеятельности животных и растительных организмов.

Гликокаликс- надмембранный комплекс, состоит из сахаридов, связанных с белками и сахаридов, связанных с липидами. Функции n Рецепция (гормоны, цитокины, медиаторы и антигены) n Межклеточные взаимодействия(раздражимость и узнавание) n Пристеночное пищеварение (микроворсинки каемчатых клеток кишечника)

Функции цитолеммы: - разграничительная; - активный и пассивный транспорт веществ в обе стороны; - рецепторные функции; -контакт с соседними клетками.

2. Объекты исследования гистологии

3. Приготовление гистологических препаратов

4. Методы исследования

5. Исторические этапы развития гистологии

1. Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов. Следовательно, гистология изучает один из уровней организации живой материи тканевой. Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

клеточный;

тканевой;

структурно-функциональные единицы органов;

органный уровень;

системный уровень;

организменный уровень

Гистология, как учебная дисциплина , включает в себя следующие разделы: цитологию, эмбриологию, общую гистологию (изучает строение и функции тканей), частную гистологию (изучает микроскопическое строение органов).

Основным объектом изучения гистологии является организм здорового человека и потому данная учебная дисциплина именуется как гистология человека.

Основная задача гистологии состоит в изучении строения клеток, тканей, органов, установления связей между различными явлениями, установление общих закономерностей.

Гистология, как и анатомия, относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом, изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры. Наконец, изучаемые структуры обычно рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном (эмбриональном) периоде, так и на протяжении постэмбрионального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения эмбриологии в курс гистологии.

Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

2. Объекты исследования подразделяются на:

живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.

Гистологический препарат может быть в виде:

тонкого окрашенного среза органа или ткани;

мазка на стекле;

отпечатка на стекле с разлома органа;

тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

сохранять прижизненное состояние структур;

быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;

быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;

препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

3. Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа; забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка; обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

4. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;

ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);

люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;

фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;

поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;

микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;

микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;

электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.

5. В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге "Микрография", в-третьих, впервые ввел термин "клетка" ("целлюля"). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках "протоплазмы" (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

все растительные и животные организмы состоят из клеток;

все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;

каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.

Современные положения клеточной теории:

клетка является наименьшей единицей живого;

клетки животных организмов сходны по своему строению;

размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;

многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.

Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:

клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;

сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;

митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

ЛЕКЦИЯ 2. Цитология. Цитоплазма

Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии Часть I к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов д.м.н., профессор С.В. Диндяев Ивановская государственная медицинская академия Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии далее

Оглавление Введение Методы исследования живых клеток и тканей Виды гистологических препаратов фиксированных клеток Изготовление гистологического препарата Гистологический препарат Взятие материала Фиксация материала Уплотнение материала Приготовление срезов Виды микротомов Окрашивание срезов Методы окрашивания Типы красителей Заключение срезов в консервирующую среду Методы микроскопии Световая микроскопия Устройство светового микроскопа Техника микроскопирования Темнопольная микроскопия Поляризационная микроскопия Фазово-контрастная микроскопия Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия Электронная микроскопия Рекомендуемая литература далееназад

Введение В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов. Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования подготовка его к микроскопированиюподготовка его к микроскопированию применение методов микроскопированияприменение методов микроскопирования качественный и количественный анализ изображения Объектами исследования служат гистологические препараты, изготовленные из живых или фиксированных клеток.гистологические препаратыживыхфиксированных клеток оглавлениедалее

Методы исследования живых клеток и тканей далее Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения, деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов. Методы Прижизненное в организме (in vivo) Прижизненное в культуре клеток и тканей (in vitro) Вживление прозрачных камер Прижизненная микроскопия Трансплантация Суспензионные культуры Монослойные культуры Культивирование in vivo оглавление назад

Виды гистологических препаратов фиксированных клеток Мазок ОтпечатокСрезПленка крови красного костного мозга спинно- мозговой жидкости слюны влагалищный и др. селезенки тимуса печени слизистой оболочки мочевого пузыря слизистой оболочки щеки и др. брюшины плевры мягкой мозговой оболочки соединительной ткани и др. далееоглавлениеназад тонкие (толщина более 1 мкм) полутонкие (толщина менее 1 мкм) ультратонкие (толщина менее 0,1 мкм)

Гистологический препарат далее Гистологические препаратыГистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной 5-15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенные специальными гистологическими красителями. Гистологический препарат должен отвечать следующим требованиям: сохранять прижизненное состояние структур; быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете; быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться; препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения. Процесс изготовления гистологического препарата включает включает следующие основные этапы: 1.Взятие и фиксация материалаВзятиефиксация материала 2.Уплотнение материалаУплотнение материала 3.Приготовление срезовПриготовление срезов 4.Окрашивание срезовОкрашивание срезов 5.Заключение срезов в прозрачную средуЗаключение срезов в прозрачную среду оглавление назад

Взятие материала Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей, полученных несколькими путями: биопсия (пунктат), операционным путем, секционный (трупный) материал, экспериментальный При этом должны учитываться следующие моменты: 1.Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа. 2.Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани. 3.Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка. 4.Обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее). оглавление назад далее

Фиксация материала назад Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений. Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.). Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО 2, жидким азотом и др.). Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов. оглавлениедалее

Уплотнение материала назад Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины. Этого достигают двумя способами: Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем микротоме. Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.) Основные этапы парафиновой проводки: Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления фиксатора. Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%). Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и ксилола (при температуре 37°С) Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С). Охлаждение парафина и формирование блоков. оглавлениедалее

Приготовление срезов назад Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии) и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).микротомы Специальные ножи микротомов позволяют получить срезы толщиной: 3-8 мкм из материала, залитого в парафин, мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата 0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной микроскопии). оглавлениедалее

Виды микротомов ротационныйкриостатныйсанный заморажи- вающий для экспресс- диагностики, гистохимии изготовление серийных парафиновых срезов изготовление парафиновых срезов изготовление срезов при температуре -20°С и ниже для гистохимии и иммуноцито- химии вибротом изготовление срезов фикси- рованных и нефиксирован- ных тканей оглавление назад далее

Окрашивание срезов Клеточные структуры без специальной обработки, как правило, не различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и прозрачны. Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.красители Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав. Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100, 96, 90, 80, 70%) и помещают в воду. оглавление назаддалее

Специальные Методы окрашивания Общегисто- логические оглавлениеназад ИмпрегнацияГисто- химические выявление общего плана строения клеток, тканей, органов выявление специализи- рованных структур в клетках и тканях анализ химического состава клеток и межклеточного вещества выявление специализи- рованных структур в клетках и тканях далее

Импрегнация назад Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др.). Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в зависимости от количества и свойств восстановленного металла. оглавление Периферический нерв (поперечный срез). Импрегнация оксидом осмия Мультиполярный нейрон. Импрегнация нитратом серебра Мультиполярные нейроны. Импрегнация нитратом серебра далее

Основныекислыенейтральные основания, связываясь с кислотными соединениями гистологических структур, вызывают обычно их окрашивание в сине- фиолетовые цвета соединяясь с основными (щелочными) соединениями гистологических структур, окрашивают их в цвета красителя содержат как основные, так и кислые красящие компоненты базофилия нейтрофилия метахромазия оксифилия Типы общегистологических красителей назадоглавлениедалее

Базофилия Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК. К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин, метиленовый синий, азуры и др. Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь). базофилией Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными. В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК), иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС). Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например, хрящевой. оглавление назаддалее Базофилия ядра нейтрофильного гранулоцита. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение: х630.

Метахромазия Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета некоторых основных красителей при их связывании со структурами, обладающими специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией сульфатированных гликозаминогликанов). К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др. Способность метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных лейкоцитов, тучных клеток. Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и chroma – краска). оглавление назаддалее Метахромазия зернистости базофильного гранулоцита. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение: х630.

Оксифилия Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд – например, белки. К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др. Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).оксифилией Структуры, связывающие эти красители, называются оксифильными или ацидофильными. Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна). оглавление назаддалее Оксифилия зернистости эозинофильного гранулоцита. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение: х630.

Нейтрофилия Нейтрофилия (от лат. neutrum – ни тот, ни другой, и philia - предрасположение, любовь) – способность гистологических структур окрашиваться и кислыми, и основными красителями. оглавление назаддалее Нейтрофилия зернистости нейтрофильного гранулоцита. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение: х630.

Заключение срезов в консервирующую среду назад Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают (монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев – канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды). На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами (предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла. оглавлениедалее

Световая микроскопия далее Изучение гистологического препарата осуществляется в проходящем свете с помощью светового микроскопа.светового микроскопа Источник света естественный или искусственный (различные лампы). Свет собирается в конденсор и далее направляется через препарат в объектив. Окуляр дополнительно увеличивает это изображение.конденсоробъектив Окуляр Качество изображения (четкость) определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. минимальным (разрешающим) расстоянием, на котором оптика микроскопа позволяет различить раздельно две близко расположенные точки. Эта величина пропорциональна длине световой волны и для обычного светового микроскопа равна приблизительно 0,2 мкм. Чем меньше разрешающее расстояние, тем выше разрешающая способность микроскопа и тем более мелкие объекты можно исследовать. Увеличение микроскопа – это соотношение между истинными размерами исследуемого объекта и размерами его изображения, получаемого с помощью микроскопа. Ориентировочно оно оценивается как произведение увеличений объектива и окуляра и может достигать 2500 раз. объективаокуляра оглавлениеназад

Устройство светового микроскопа 1.Основание микроскопа 2.Тубусодержатель 3.Тубус 4.Окуляр (чаще ×7) 5.Револьвер микроскопа 6.Объективы а) сухие: ×8, ×20, ×40 б) иммерсионный ×90 7.Предметный столик 8.Конденсор 9.Макрометрический винт 10.Микрометрический винт 11.Винт конденсора 12.Зеркало Общее увеличение микроскопа = увеличение объектива × увеличение окуляра назадоглавление далее

Техника микроскопирования 1.Микроскопирование гистологического препарата начинают с установки правильного освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок света, и конденсора достигают равномерного освещения поля зрения.вогнутого зеркалаконденсора 2.На предметный столик помещают гистологический препарат покровным стеклом вверх. 3.Изучение гистологического препарата начинают при малом увеличении (объектив х8), при этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см. Установку резкости проводят с помощью макровинта.малом увеличениимакровинта 4.Рассматривают детали гистологического препарата по всей площади, перемещая его на предметном столике. 5.Устанавливают в центр поля зрения участок гистологического препарата, который следует изучить при большом увеличении (объектив х40).большом увеличении 6.С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением (х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.револьверного устройствамикровинта 7.Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный объектив (х90).иммерсионный объектив На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла. Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу. Установку резкости проводят с помощью микровинта.микровинта После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей. оглавлениеназад далее

Техника микроскопирования (примеры) оглавлениеназад Почка. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 56 (малое увеличение). Почка. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 280 (большое увеличение). Почка. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 630 (иммерсионное увеличение). далее

Темнопольная микроскопия назад Основана на использовании специального конденсора, освещающего препарат «косыми» лучами, не попадающими в объектив. При наличии объекта в поле зрения свет отражается от него и направляется в объектив. Метод часто используется для изучения живых неокрашенных клеток. оглавлениедалее

Поляризационная микроскопия назад Позволяет обнаружить двойное лучепреломление – анизотропию. На объект исследования направляется поляризованный пучок света, т.е. лучи света направлены строго в одной плоскости. Это обеспечивает особый фильтр – поляризатор. Такой свет направляется на объект исследования. Второй фильтр – анализатор расположен между объективом и окуляром и позволяет регистрировать угол отклонения плоскости поляризации света. Микроскопия позволяет регистрировать пространственное расположение молекул в объективе или кристаллические структуры. оглавление Кристаллы оксалатов. Поляризационная микроскопия. Увеличение х100 далее

Фазово-контрастная микроскопия назад Метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, в частности, позволяет изучать живые неокрашенные препараты. Даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые глазом, преобразуются с помощью специального оптического устройства (кольцевой диафрагмы в конденсоре и фазовой пластинки в объективе) в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово- контрастным. оглавление Семенники крысы. Неокрашенный препарат. Фазовый контраст Семенники крысы. Окраска: гематоксилин-эозин Световая микроскопия Pseudotrichonympha grassi. Неокрашенный препарат. Фазовый контраст далее

Использует принцип свечения объекта исследования при освещении его ультрафиолетовыми лучами. Источником света служат специальные лампы. Существует аутофлюоресценция – собственная или первичная флюоресцен-ция. Например, свечение эластических волокон в стенке артерий. Вторичная флюоресценция возникает после обработки препаратов специальными красителями – флюорохромами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцин и др.). Например: после обработки акридиновым оранжевым в клетке очень четко обнаруживается ядерная ДНК (ярко-зеленое свечение) и РНК (ярко-красное свечение). После фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька) обнаруживается ярко-зеленое свечение серотонина, катехоламинов (адреналин, норадреналин).акридиновым оранжевымметод Фалька Если флюоресцентные красители связать со специфическими антителами – можно будет выявить их антигены. Этот метод получил название иммуноцитохимического. иммуноцитохимического Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия назадоглавлениедалее

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (примеры) Цитоскелет эукариот (эндотелиальные клетки быка). Имунноцитохимический метод окрашивания. Актиновые микрофиламенты окрашены в красный, микротрубочки в зеленый, ядра клеток в голубой цвет. назад.... Нуклеиновые кислоты в эпителии маточных желез. Окраска акридиновым оранжевым. Ядерная ДНК окрашена в зеленый цвет, РНК – в красный. Симпатические нервные сплетения. Метод Фалька оглавлениедалее

Электронная микроскопия назад Электронный микроскоп прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 10 6 раз. Это стало возможно благодаря использованию вместо светового потока пучка электронов, длина волны которого во много раз короче длины волны фотонов видимого света. Электронный микроскоп состоит из электронной пушки (устройства для получения пучка электронов) и системы электромагнитных линз, размещенных в колонне микроскопа в условиях вакуума. Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может составлять менее 0,1 нм (м). Существуют две основные разновидности электронной микроскопии: трансмиссионная (просвечивающая) и сканирующая (растровая). трансмиссионнаясканирующая оглавлениедалее

Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия примеры Принцип работы трансмиссионного электронного микроскопа заключается в том, что электроны, проходя через объект, расположенный вблизи объективной линзы, взаимодействуют с его атомами и отклоняются от первоначального направления падения пучка (рассеиваются). Далее они попадают в систему магнитных линз, которые формируют на флуоресцентном экране (и на фотопленке) изображение внутренней структуры объекта. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,510 6 раз. Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. Для получения контрастного изображения применяют ультратонкие срезы (не более 0,01 мкм), обработанные соединениями тяжелых металлов (импрегнация солями свинца, урана, осмия и др.), избирательно взаимодействующими с компонентами микроструктуры (химическое контрастирование). При этом чем большей рассеивающей способностью обладает участок исследуемого объекта (участки повышенной плотности, увеличенной толщины и пр.), тем более темным будет его изображение.изображение оглавление назад

Сканирующая (растровая) электронная микроскопия Принцип работы сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) заключается в сканировании поверхности образца сфокусированным электронным пучком и анализе отраженных от нее частиц и рентгеновского излучения, возникающего в результате взаимодействия электронов с веществом. В СЭМ пучок электронов (электронный зонда) фокусируется электромагнитными линзами конденсора и объектива. Специальное устройство – дефлектор отклоняет электронный пучок (первичные электроны), который скользит по поверхности (растр). Вторичные электроны (отраженные от поверхности) воспринимаются детектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение.трехмерное изображение Современный СЭМ позволяет работать в широком диапазоне увеличений приблизительно от х10 (что эквивалентно увеличению сильной ручной линзы) до х, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения лучших оптических микроскопов. Поверхность сканирования обязательно напыляется металлом: платина, золото, палладий и др. оглавление назад примеры

Электронная микроскопия (примеры) трансмиссионнаясканирующая Тучная клетка назад Эритроциты в артериоле Эритроцит, тромбоцит, лейкоцит оглавление далее

Рекомендуемая литература назад 1.Гистология, цитология и эмбриология: Учебник. / Под ред. Ю.А.Афанасьева, С.Л.Кузнецова, Н.А.Юриной. – М.: Медицина, – 768 с. 2.Гистология, эмбриология, цитология: Учебник. / Под ред. Э.Г.Улумбекова, Ю.А.Челышева. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», – 408 с. 3.Жункейра Л.К., Карнейро Ж. Гистология: Атлас: Уч.пос.; пер. с англ., под ред. В.Л. Быкова. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», – 576 с. 4.Хэм А., Кормак Д. Гистология: в 5 томах; пер. с англ. – М.: Мир, оглавление

Главная » Полезно знать » Современные методы исследования в гистологии. Объекты исследования гистологии