Физические факторы действующие на микроорганизмы. Влияние физических, химических и биологических факторов на микроорганизмы

Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий окружающей среды. Все факторы окружающей среды, оказывающие влияние на микроорганизмы, можно разделить на три группы: физические, химические и биологические, благоприятное или губительное действие которых зависит как от природы самого фактора, так и от свойств микроорганизма.

Физические факторы

Из физических факторов наибольшее влияние на развитие микроорганизмов оказывают температура, высушивание, лучистая энергия, ультразвук.

Температура . Жизнедеятельность каждого микроорганизма ограничена определенными температурными границами. Эту температурную зависимость обычно выражают тремя основными точками: минимум - температура, ниже которой размножение микробных клеток прекращается; оптимум - наилучшая температура для роста и развития микроорганизмов; максимум - температура, выше которой жизнедеятельность клеток ослабляется или прекращается. Оптимальная температура обычно соответствует температурным условиям естественной среды обитания.

Все микроорганизмы по отношению к температуре подразделяются на психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы (от греч. psychros - холодный, phileo - люблю), или холодолюбивые микроорганизмы, растут при относительно низких температурах: минимальная температура - 0° С, оптимальная - 10-20° С, максимальная - 30° С. Эта группа включает микроорганизмы, обитающие в северных морях и океанах, почве, сточных водах. Сюда же относятся светящиеся и железобактерии, а также микробы, вызывающие порчу продуктов на холоду (ниже 0° С).

Мезофилы (от греч. mesos - средний) - наиболее обширная группа, включающая большинство сапрофитов и все патогенные микроорганизмы. Оптимальная температура для них 28-37° С, минимальная - 10° С, максимальная - 45° С.

Термофилы (от греч. termos - тепло, жар), или теплолюбивые микроорганизмы, развиваются при температуре выше 55° С, температурный минимум для них 30° С, оптимум - 50-60° С, а максимум - 70-75° С. Они встречаются в горячих минеральных источниках, поверхностном слое почвы, самонагревающихся субстратах (навозе, сене, зерне), кишечнике человека и животных. Среди термофилов много споровых форм.

Высокие и низкие температуры оказывают различное влияние на микроорганизмы. Одни более чувствительны к высоким температурам. Причем, чем выше температура за пределами максимума, тем быстрее наступает гибель микробных клеток, что обусловлено денатурацией (свертыванием) белков клетки.

Вегетативные формы бактерий мезофилов погибают при температуре 60° С в течение 30-60 мин, а при 80-100° С - через 1-2 мин. Споры бактерий гораздо устойчивее к высоким температурам. Например, споры бацилл сибирской язвы выдерживают кипячение в течение 10-20 мин, а споры клостридий ботулизма - 6 ч. Все микроорганизмы, включая споры, погибают при температуре 165-170° С в течение часа (в сухожаровом шкафу) или при действии пара под давлением 1 атм (в автоклаве) в течение 30 мин.

Действие высоких температур на микроорганизмы положено в основу стерилизации - полного освобождения разнообразных объектов от микроорганизмов и их спор (см. ниже).

К действию низких температур многие микроорганизмы чрезвычайно устойчивы. Сальмонеллы тифа и холерный вибрион длительно выживают во льду. Некоторые микроорганизмы остаются жизнеспособными при температуре жидкого воздуха (-190° С), а споры бактерий выдерживают температуру до -250° С.

Только отдельные виды патогенных бактерий чувствительны к низким температурам (например, бордетеллы коклюша и паракоклюша, нейссерии менингококка и др.). Эти свойства микроорганизмов учитывают в лабораторной диагностике и при транспортировке исследуемого материала - его доставляют в лабораторию защищенным от охлаждения.

Действие низких температур приостанавливает гнилостные и бродильные процессы, Что широко применяется для сохранения пищевых продуктов в холодильных установках, погребах, ледниках. При температуре ниже 0° С микробы впадают в состояние анабиоза - наступает замедление процессов обмена веществ и прекращается размножение. Однако при наличии соответствующих температурных условий и питательной среды жизненные функции микробных клеток восстанавливаются. Это свойство микроорганизмов используется в лабораторной практике для сохранения культур микробов при низких температурах. Губительное действие на микроорганизмы оказывает также быстрая смена высоких и низких температур (замораживание и оттаивание) - это приводит к разрыву клеточных оболочек.

Высушивание . Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов необходима вода. Высушивание приводит к обезвоживанию цитоплазмы, нарушению целостности цитоплазматической мембраны, вследствие чего нарушается питание микробных клеток и наступает их гибель.

Сроки отмирания разных видов микроорганизмов под влиянием высушивания значительно отличаются. Так, например, патогенные нейссерии (менингококки, гонококки), лептоспиры, бледная трепонема и другие погибают при высушивании через несколько минут. Холерный вибрион выдерживает высушивание 2 сут, сальмонеллы тифа - 70 сут, а микобактерии туберкулеза - 90 сут. Но высохшая мокрота больных туберкулезом, в которой возбудители защищены сухим белковым чехлом, остается заразной 10 мес.

Особой устойчивостью к высушиванию, как и к другим воздействиям окружающей среды, обладают споры. Споры бацилл сибирской язвы сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов - до 20 лет.

Неблагоприятное действие высушивания на микроорганизмы издавна используется для консервирования овощей, фруктов, мяса, рыбы и лекарственных трав. В то же время, попав в условия повышенной влажности, такие продукты быстро портятся из-за восстановления жизнедеятельности микробов.

Для хранения культур микроорганизмов, вакцин и других биологических препаратов широко применяют метод лиофильной сушки. Сущность метода состоит в том, что предварительно микроорганизмы или препараты подвергают замораживанию, а затем их высушивают в условиях вакуума. При этом микробные клетки переходят в состояние анабиоза и сохраняют свои биологические свойства в течение нескольких месяцев или лет.

Лучистая энергия . В природе микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Прямые солнечные лучи вызывают гибель многих микроорганизмов в течение нескольких часов, за исключением фотосинтезирующих бактерий (зеленых и пурпурных серобактерий). Губительное действие солнечного света обусловлено активностью ультрафиолетовых лучей (УФ-лучи). Они инактивируют ферменты клетки и повреждают ДНК. Патогенные бактерии более чувствительны к действию УФ-лучей, чем сапрофиты. Поэтому хранить микробные культуры в лаборатории лучше в темноте. В этом отношении демонстративен опыт Бухнера.

В чашку Петри с тонким слоем агара производят обильный посев какой-либо культуры бактерий. На наружную поверхность засеянной чашки наклеивают вырезанные из черной бумаги буквы, образующие, например, слово "typhus". Чашку, обращенную дном вверх, подвергают облучению прямыми солнечными лучами в течение 1 ч. Затем бумажки снимают, и чашку ставят на сутки в термостат при 37° С. Рост бактерий наблюдается лишь в тех местах агара, которые были защищены от действия УФ-лучей наклеенными буквами. Остальная часть агара остается прозрачной, т. е. рост микроорганизмов отсутствует (рис. 11).

Велико значение солнечного света как естественного фактора оздоровления внешней среды. Он освобождает от патогенных бактерий воздух, воду "естественных водоемов, верхние слои почвы.

Бактерицидное (уничтожающее бактерий) действие УФ-лучей используется для стерилизации воздуха закрытых помещений (операционных, перевязочных, боксов и т. д.), а также воды и молока. Источником этих лучей являются лампы ультрафиолетового излучения, бактерицидные лампы.

Другие виды лучистой энергии - рентгеновские лучи, α-, β-, γ-лучи оказывают губительное действие на микроорганизмы только в больших дозах, порядка 440-280 Дж/кг. Гибель микробов обусловлена разрушением ядерных структур и клеточной ДНК. Малые дозы излучений стимулируют рост микробных клеток. Микроорганизмы значительно устойчивее к радиоактивным излучениям, чем высшие организмы. Известны тионовые бактерии, обитающие в залежах урановых руд. Бактерии обнаруживали в воде атомных реакторов при концентрации ионизирующей радиации 20-30 кДж/кг.

Бактерицидное действие ионизирующего излучения используется для консервирования некоторых пищевых продуктов, стерилизации биологических препаратов (сывороток, вакцин и др.), при этом свойства стерилизуемого материала не изменяются.

В последние годы радиационным методом стерилизуют изделия для одноразового использования - полистироловые пипетки, чашки Петри, лунки для серологических реакций, шприцы, а также шовный материал - кетгут и др.

Ультразвук вызывает значительное поражение микробной клетки. Под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются, и внутри клетки возникает высокое давление (до 10000. атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

Высокое давление . К механическому давлению бактерии и особенно их споры устойчивы. В природе встречаются бактерии, живущие в морях и океанах на глубине 1000-10000 м под давлением от 100 до 900 атм. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3000-5000 атм, а бактериальные споры - даже 20000 атм.

Химические факторы

Влияние химических веществ на микроорганизмы различно в зависимости от природы химического соединения, его концентрации, продолжительности воздействия на микробные клетки. В зависимости от концентрации химическое вещество может быть источником питания или оказывать угнетающее действие на жизнедеятельность микроорганизмов. Например, 0,5-2% раствор глюкозы стимулирует рост микробов, а 20-40% растворы глюкозы задерживают размножение микробных клеток.

Многие химические соединения, оказывающие губительное действие на микроорганизмы, используются в медицинской практике в качестве дезинфицирующих веществ и антисептиков.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, называют дезинфицирующими. Под дезинфекцией понимают мероприятия, направленные на уничтожение патогенных микроорганизмов в различных объектах окружающей среды. К дезинфицирующим веществам относят галлоидные соединения, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, некоторые кислоты, щелочи, спирты и др. Они вызывают гибель микробных клеток, действуя в оптимальных концентрациях, в течение определенного времени. Многие дезинфицирующие вещества оказывают вредное воздействие на ткани макроорганизма.

Антисептиками называют химические вещества, которые могут вызывать гибель микроорганизмов или задерживать их рост и размножение. Их используют с лечебной целью (химиотерапия), а также для обеззараживания ран, кожи, слизистых оболочек человека. Антисептическими свойствами обладают перекись водорода, спиртовые растворы йода, бриллиантового зеленого, растворы перманганата калия и др. Некоторые антисептические вещества (уксусная, сернистая, бензойная кислоты и др.) в дозах, безвредных для человека, применяют для консервирования пищевых продуктов.

По механизму действия химические вещества, обладающие противомикробной активностью, можно подразделить на несколько групп.

1. Поверхностно-активные вещества (жирные кислоты, мыла и прочие детергенты) вызывают снижение поверхностного натяжения, что приводит к нарушению функционирования клеточной стенки и цитоплазматической мембраны микроорганизмов.

2. Фенол, крезол и их производные вызывают коагуляцию микробных белков. Они используются для дезинфекции заразного материала в микробиологической практике и инфекционных больницах.

3. Окислители, взаимодействуя с микробными белками, нарушают деятельность ферментов, вызывают денатурацию белков. Активными окислителями являются хлор, озон, которые используют для обеззараживания питьевой воды. Хлорпроизводные вещества (хлорная известь, хлорамин) широко употребляют в целях дезинфекции. Окисляющими свойствами обладают перекись водорода, перманганат калия, йод и др.

4. Формальдегид применяют в виде 40% раствора (формалин) для дезинфекции. Он убивает вегетативные и споровые формы микроорганизмов. Формалин блокирует аминогруппы белков микробной клетки и вызывает их денатурацию.

5. Соли тяжелых металлов (ртуть, свинец, цинк, золото и др.) коагулируют белки микробной клетки, вызывая этим их гибель. Ряд металлов (серебро, золото, ртуть и др.) оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы в ничтожно малых концентрациях. Это свойство получило название олигодинамического действия (от лат. oligos - малый, dinamys - сила). Доказано, что вода, находящаяся в сосудах из серебра, не загнивает, благодаря бактерицидному действию ионов серебра. Для профилактики бленнореи * новорожденных долгое время применяли 1% раствор нитрата серебра. Коллоидные растворы органических соединений серебра (протаргол, колларгол) используют также в виде местных антисептических средств.

* (Бленнорея - воспаление конъюнктивы глаза, вызванное гонококками. )

Сильным антимикробным действием обладают препараты ртути. Издавна для дезинфекции применяли бихлорид ртути, или сулему (в разведении 1:1000). Однако она оказывает токсическое действие на ткани макроорганизма и использование ее ограничено.

6. Красители (бриллиантовый зеленый, риванол и др.) обладают свойством задерживать рост бактерий. Растворы ряда красителей применяют в качестве антисептических средств, а также вводят в состав некоторых питательных сред для угнетения роста сопутствующей микрофлоры.

Губительное действие ряда физических и химических факторов на микроорганизмы составляет основу асептического и антисептического методов, широко используемых в медицинской и санитарной практике.

Асептика - система профилактических мероприятий, препятствующих микробному загрязнению объекта (раны, операционного поля, культур микроорганизмов и т. д.), основанная на физических методах.

Антисептика - комплекс мер, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, целом организме или на объектах внешней среды, с применением различных обеззараживающих химических веществ.

Биологические факторы

В естественных условиях обитания микроорганизмы существуют не изолированно, а находятся в сложных взаимоотношениях, которые сводятся в основном к симбиозу, метабиозу и антагонизму.

Симбиоз - это сожительство организмов различных видов, приносящих им взаимную пользу. При этом совместно они развиваются лучше, чем каждый из них в отдельности.

Симбиотические взаимоотношения существуют между клубеньковыми бактериями и бобовыми растениями, между мицелиальными грибами и сине-зелеными водорослями (лишайниками): Симбиоз молочно-кислых бактерий и спиртовых дрожжей используют для приготовления некоторых молочно-кислых продуктов (кефир, кумыс).

Метабиоз - такой вид взаимоотношений, при котором продукты обмена одного вида микроорганизмов создают необходимые условия для развития других. Например, гнилостные микроорганизмы, расщепляющие белковые вещества, способствуют накоплению в среде аммонийных соединений и создают благоприятные условия для роста и развития нитрифицирующих бактерий. А развитие анаэробов в хорошо аэрируемой почве было бы невозможно без аэробов, поглощающих свободный кислород.

Метабиотические взаимоотношения широко распространены среди почвенных микроорганизмов и лежат в основе круговорота веществ в природе.

Антагонизм - форма взаимоотношений, при которой один микроорганизм угнетает развитие другого или может вызвать его полную гибель. Антагонистические взаимоотношения выработались у микроорганизмов в борьбе за существование. Повсюду, где они обитают, между ними идет непрерывная борьба за источники питания, кислород воздуха, среду обитания. Так, большинство патогенных бактерий, попав с выделениями больных во внешнюю среду (почву, воду), не выдерживают здесь длительной конкуренции с многочисленными сапрофитами и сравнительно быстро погибают.

Антагонизм может быть обусловлен прямым воздействием микроорганизмов друг на друга или действием продуктов их обмена. Например, простейшие пожирают бактерий, а фаги лизируют их. Кишечник новорожденных заселяют молочно-кислые бактерии Bifidobacterium bifidum. Выделяя молочную кислоту, они подавляют рост гнилостных бактерий и этим защищают от кишечных Расстройств еще малоустойчивый организм грудных детей. Некоторые микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают различные вещества, оказывающие губительное действие на бактерии и другие микробы. К таким веществам относят антибиотики (см. "Антибиотики").

Контрольные вопросы

1. Какие физические факторы оказывают влияние на жизнедеятельность микроорганизмов?

2. Какие вещества относит к дезинфицирующим и как они различаются по механизму воздействия на микроорганизмы?

3. Перечислите, какие взаимоотношения существуют между микроорганизмами?

Стерилизация

Стерилизация - это обеспложивание, т. е. полное освобождение объектов окружающей среды от микроорганизмов и их спор.

Стерилизацию производят различными способами:

1) физическими (воздействие высокой температуры, УФ-лучей, использование бактериальных фильтров);

2) химическими (использование различных дезинфектантов, антисептиков);

3) биологическим (применение антибиотиков).

В лабораторной практике обычно применяют физические способы стерилизации.

Возможность и целесообразность использования того или иного способа стерилизации обусловлена особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими и химическими свойствами.

Физические способы

Прокаливание в пламени горелки или фламбирование - способ стерилизации, при котором происходит полное обеспложивание объекта, так как погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Обычно прокаливают бактериологические петли, шпатели, пипетки, предметные и покровные стекла, мелкие инструменты. Не следует стерилизовать прокаливанием ножницы, скальпели, так как под действием огня режущая поверхность становится тупой.

Сухожаровая стерилизация

Стерилизацию сухим жаром или горячим воздухом осуществляют в печах Пастера (сушильных сухожаровых шкафах). Печь Пастера - шкаф с двойными стенками, изготовленный из термостойких материалов - металла и асбеста. Нагревают шкаф с помощью газовых горелок или электронагревательных приборов. Шкафы с электрическим нагревом снабжены регуляторами, обеспечивающими необходимую температуру. Для контроля температуры имеется термометр, вставленный в отверстие верхней стенки шкафа.

Сухим жаром стерилизуют в основном лабораторную Посуду. Подготовленную для стерилизации посуду неплотно загружают в печь, чтобы обеспечить равномерный и надежный прогрев стерилизуемого материала. Дверь шкафа плотно закрывают, включают обогревательный прибор, доводят температуру до 160-165° С и при этой температуре стерилизуют 1 ч. По окончании стерилизации выключают обогрев, но дверцу шкафа не открывают до тех пор, пока печь не остынет; в противном случае холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизацию в печи Пастера можно проводить при различном температурном режиме и экспозиции (время стерилизации) (табл. 1).

Жидкости (питательные среды, изотонический раствор хлорида натрия и др.), предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром нельзя, так как жидкости вскипают и выливаются, а резина и синтетические материалы плавятся.

Для контроля стерилизации в печи Пастера шелковые нити смачивают в культуре спорообразующих бактерий, подсушивают, помещают в стерильную чашку Петри и ставят в печь Пастера. Стерилизацию проводят при температуре 165° С 1 ч (для контроля часть нитей оставляют при комнатной температуре). Затем простерилизованные и контрольные нити кладут на поверхность агара в чашку Петри или помещают в пробирки с бульоном и инкубируют в термостате при температуре 37° С в течение 2 сут. При правильной работе печи Пастера в пробирках или чашках с питательными средами, куда были помещены простерилизованные нити, роста не будет, так как споры бактерий погибнут, в то время как споры бактерий на нитях, не подвергавшихся стерилизации (контрольные), прорастут и на питательных средах будет отмечен рост.

Для определения температуры внутри печи Пастера можно использовать сахарозу или пищевой сахарный песок, карамелизующиеся при температуре 165-170° С.

Подготовка лабораторной посуды к стерилизации в печи Пастера . Лабораторную посуду (чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, флаконы, колбы, пробирки) перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть, высушить и завернуть в бумагу, иначе после стерилизации она может снова загрязниться бактериями воздуха.

Чашки Петри завертывают в бумагу по одной или несколько штук либо укладывают в специальные металлические пеналы.

В верхние концы пипеток вставляют ватные тампоны, предупреждающие попадание исследуемого материала в рот. Градуированные пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. На бумаге отмечают объем завернутой пипетки. В пеналах градуированные пипетки стерилизуют без дополнительного завертывания в бумагу.

Примечание . Если градуировка на пипетках плохо заметна, ее восстанавливают перед стерилизацией. На пипетку наносят масляную краску и, не дав краске высохнуть, в нее втирают с помощью тряпочки порошок бария сульфата. После этого тряпкой снимают избыток краски, которая остается только в насечках градуировки. Обработанные таким образом пипетки следует сполоснуть.

Острые концы пастеровских пипеток запаивают в пламени горелки и заворачивают в бумагу по 3-5 штук. Заворачивать пастеровские пипетки нужно осторожно, чтобы не обломать запаянные концы капилляров.

Флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробка должна входить в горлышко сосуда на 2 / 3 своей длины, не слишком туго, но и не свободно. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок. Пробирки связывают по 5-50 штук и обертывают поверх бумагой.

Примечание . При высоких температурах бумага, в которую завертывают чашки и пипетки, и вата желтеют и даже могут обугливаться, поэтому каждый новый сорт бумаги, получаемый лабораторией, следует испытывать при принятом температурном режиме.

Контрольные вопросы

1. Что понимают под термином стерилизация?

2. Какими способами проводят стерилизацию?

3. Что стерилизуют прокаливанием на огне?

4. Опишите устройство и режим работы печи Пастера.

5. Что стерилизуют в печи Пастера?

6. Как подготавливают стеклянную посуду к стерилизации?

7. Почему в печи Пастера нельзя стерилизовать питательные среды и предметы из резины?

Задание

Подготовьте к стерилизации чашки Петри, градуированные пипетки, пастеровские пипетки, пробирки, колбы и флаконы.

Стерилизация кипячением

Кипячение - способ стерилизации, гарантирующий обеспложивание при условии отсутствия в стерилизуемом материале спор. Применяют для обработки шприцев инструментов, стеклянной и металлической посуды резиновых трубок и т. п.

Стерилизацию кипячением обычно проводят в стерилизаторе - металлической коробке прямоугольной формы с плотно закрывающейся крышкой. Стерилизуемый материал помещают на имеющуюся в стерилизаторе сетку и заливают водой. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 1-2% гидрокарбонат натрия (лучше пользоваться дистиллированной водой). Стерилизатор закрывают крышкой и подогревают Началом стерилизации считают момент закипания воды, время кипячения 15-30 мин. По окончании стерилизации сетку с инструментами извлекают за боковые ручки специальными крючками, а находящиеся в ней инструменты берут стерильным пинцетом или корнцангом, который кипятят вместе с остальными инструментами.

Стерилизацию паром производят двумя способами: 1) паром под давлением; 2) текучим паром.

Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Этот способ стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного водяного пара при давлении выше атмосферного. В результате такой стерилизации при однократной обработке погибают как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов.

Автоклав (рис. 12) - массивный котел, снаружи покрытый металлическим кожухом, герметически закрыт крышкой, которая плотно привинчивается к котлу откидывающимися болтами. В наружный котел вставлен другой, меньшего диаметра, который называют стерилизационной камерой. В эту камеру помещают предметы, подлежащие стерилизации. Между обоими котлами имеется свободное пространство, называемое водопаровой камерой. В эту камеру через воронку, укрепленную снаружи, наливают воду до определенного уровня, отмеченного на специальной водомерной трубке. При кипячении воды в водопаровой камере образуется пар. Стерилизационная камера снабжена выпускным краном с предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления сверх необходимого. Для определения давления, создающегося в стерилизационной камере, служит манометр.

Рис. 12. Схема автоклава. М - манометр; ПК - предохранительный клапан; В - воронка для воды; К 2 - кран для выпуска воды; К 3 - кран для выпуска пара

Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимают за нуль. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 2).

В настоящее время имеются автоклавы с автоматическим регулированием режима работы. Кроме обычного манометра, они снабжены электроконтактным манометром, который препятствует увеличению давления выше заданной величины и тем самым обеспечивает постоянство нужной температуры в автоклаве.

Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки), жидкости (изотонический раствор хлорида натрия, воду и т. д.); приборы, особенно имеющие резиновые части.

Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяется их составом, указанным в рецепте приготовления питательной среды. Например, простые среды (мясопептонный агар, мясопептонный бульон) стерилизуют 20 мин при 120° С (1 атм). Однако при этой температуре нельзя стерилизовать среды, содержащие нативные белки, углеводы и другие легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100° С или в автоклаве при 112° С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют 20 мин при 120° С (1 атм).

Внимание! В автоклавах производят также обезвреживание инфицированного материала. Чашки и пробирки, содержащие культуры микроорганизмов, помещают в специальные металлические ведра или баки с отверстиями в крышке для проникновения пара и стерилизуют в автоклаве при 126° С (1,5 атм) в течение 1 ч. Таким же образом стерилизуют инструменты после работы с бактериями, образующими споры.

К работе с автоклавом допускаются только специально подготовленные лица, которые должны строго и точно выполнять правила, указанные в инструкции, прилагаемой к аппарату.

Техника автоклавирования . 1. Перед работой проверяют исправность всех частей и притертость кранов.

2. Через воронку, укрепленную снаружи котла, до верхней метки водомерного стекла заливают воду (дистиллированную или кипяченую, чтобы не образовалась накипь). Кран под воронкой закрывают.

3. В стерилизационную камеру на специальную сетку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует загружать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными.

4. Резиновую прокладку на крышке натирают мелом для лучшей герметизации.

5. Крышку закрывают и болтами привинчивают к корпусу автоклава, причем болты закручивают попарно крест-накрест.

6. Открывают до отказа выпускной кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и начинают нагревать автоклав. Нагревание автоклава обычно производят с помощью газа или электричества.

При нагревании автоклава вода закипает, образующийся пар поднимается между стенками котлов и сквозь специальные отверстия, имеющиеся в стенке внутреннего котла (см. рис. 12), попадает в стерилизационную камеру и выходит через открытый выпускной кран. Сначала пар выходит вместе с воздухом, находившимся в автоклаве. Необходимо, чтобы весь воздух был вытеснен из автоклава, так как в противном случае показания манометра не будут соответствовать температуре в автоклаве.

Появление непрерывной сильной струи пара указывает на полное удаление воздуха из автоклава; после этого выпускной кран закрывают и давление, внутри автоклава начинает постепенно повышаться.

7. Началом стерилизации считают момент, когда показания манометра достигают заданной величины. Нагрев регулируют так, чтобы давление в автоклаве в течение определенного времени не изменялось.

8. По истечении времени стерилизации нагрев автоклава прекращают, пар выпускают через выпускной кран. Когда стрелка манометра опускается до нуля, открывают крышку. Чтобы избежать ожогов паром, оставшимся в автоклаве, крышку следует открывать на себя.

Уровень температуры в автоклаве, т. е. правильность показаний манометра, можно проверить. Для этого используют различные вещества, имеющие определенную точку плавления: антипирин (113° С), резорцин и серу (119° С), бензойную кислоту (120° С). Одно из этих веществ смешивают с ничтожно малым количеством красителя (фуксина или метиленового синего) и насыпают в стеклянную трубочку, которую запаивают и помещают в вертикальном положении между стерилизуемым материалом. Если температура достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет соответствующего красителя.

Для проверки эффективности стерилизации в автоклав помещают пробирку с заведомо споровой культурой. После автоклавирования пробирку переносят в термостат на 24-48 ч, отмечают отсутствие или наличие роста. Отсутствие роста свидетельствует о правильной работе прибора.

Стерилизацию текучим паром производят в аппарате Коха. Этот способ применяют в тех случаях, когда стерилизуемый объект изменяется при температуре выше 100° С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие мочевину, углеводы, молоко, картофель, желатин и др.

Аппарат (кипятильник) Коха представляет собой металлический цилиндр, обшитый снаружи (для уменьшения теплоотдачи) войлоком или асбестом. Цилиндр закрывают конической крышкой с отверстием для выхода пара. Внутри цилиндра находится подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку ставят ведро с отверстием, в которое помещают стерилизуемый материал. Нагревают аппарат Коха при помощи газа или электричества. Отсчет времени стерилизации ведут с момента энергичного выделения пара у краев крышки и из отверстия для выхода пара. Стерилизуют в течение 30-60 мин. По окончании стерилизации нагрев прекращают. Вынимают из аппарата ведро с материалом и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Прогревание проводят 3 дня подряд при температуре 100° С по 30-60 мин. Такой метод носит название дробной стерилизации. При первом прогревании гибнут вегетативные формы микробов, а споровые сохраняются. За сутки споры успевают прорасти и превратиться в вегетативные формы, которые погибают на второй день стерилизации. Так как возможно, что некоторая часть спор не успела прорасти, материал выдерживают еще 24 ч, а затем проводят третью стерилизацию. Стерилизация текучим паром в аппарате Коха не требует специального контроля, так как показателем правильной работы прибора служит стерильность приготовленных питательных сред. Стерилизовать текучим паром можно также в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране.

Контрольные вопросы

1. Какие питательные среды стерилизуют паром?

2. Что такое стерилизатор и как он устроен?

3. Почему при стерилизации кипячением следует применять дистиллированную воду?

4. Опишите устройство и режим работы автоклава.

5. Что стерилизуют в автоклаве?

6. Что служит контролем правильной стерилизации при автоклавировании?

7. Что такое стерилизация текучим паром?

8. Опишите устройство аппарата Коха.

9. С какой целью проводят дробную стерилизацию?

Задание

Заполните форму.

Дробную стерилизацию можно проводить также в свертывателе Коха.

Свертыватель Коха используют для свертывания сывороточных и яичных питательных сред, причем одновременно с уплотнением среды происходит ее стерилизация.

Свертыватель Коха представляет собой плоский металлический ящик с двойными стенками, покрытый снаружи теплоизоляционным материалом. В пространство между стенками через специальное отверстие, находящееся в верхней части наружной стенки, наливают воду. Отверстие закрывают пробкой, в которую вставлен термометр. Закрывают аппарат двумя крышками: стеклянной и металлической. Через стеклянную крышку можно наблюдать за процессом свертывания. Пробирки со средами укладывают на дно свертывателя в наклонном положении.

Нагревание свертывателя осуществляют с помощью газа или электричества. Среды стерилизуют однократно при температуре 90° С в течение 1 ч или дробно - 3 дня подряд при 80° С в течение 1 ч.

Тиндализацию * - дробную стерилизацию при низких температурах - применяют для веществ, которые легко разрушаются и денатурируются при температуре 60° С (например, белковые жидкости). Прогревание стерилизуемого материала производят на водяной бане или в специальных приборах с терморегуляторами при температуре 56-58° С в течение часа 5 дней подряд.

* (Способ стерилизации, назван по имени Тиндаля, предложившего его. )

Пастеризация - стерилизация при 65-70° С в течение 1 ч, предложена Пастером для уничтожения бесспоровых форм микробов. Пастеризуют молоко, вино, пиво, плодовые соки и другие продукты. Молоко пастеризуют с целью освобождения от молочно-кислых и патогенных бактерий (бруцеллы, микобактерии туберкулеза, шигеллы, сальмонеллы, стафилококки и др.). При пастеризации пива, плодовых соков, вина погибают микроорганизмы, вызывающие различные виды брожения. Пастеризованные продукты лучше сохранять на холоду.

Контрольные вопросы

1. Каково назначение и устройство свертывателя Коха?

2. Какие существуют способы стерилизации в свертывателе?

3. Что такое тиндализация?

4. Что такое пастеризация?

Стерилизация ультрафиолетовым облучением

Стерилизацию УФ-лучами производят при помощи специальных установок - бактерицидных ламп. УФ-лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызвать гибель не только вегетативных клеток, но и спор. УФ-облучение применяют для стерилизации воздуха в больницах, операционных, детских учреждениях и т. д. В микробиологической лаборатории УФ-лучами обрабатывают бокс перед работой.

Контрольные вопросы

1. Какими свойствами обладают ультрафиолетовые лучи?

2. В каких случаях прибегают к стерилизации методом ультрафиолетового излучения?

Механическая стерилизация при помощи бактериальных фильтров

Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случаях, когда стерилизуемые предметы изменяются при нагревании. Фильтрование проводят с помощью бактериальных фильтров, изготовленных из различных мелкопористых материалов. Поры фильтров должны быть достаточно мелкими (до 1 мкм), чтобы обеспечить механическую задержку бактерий, поэтому некоторые авторы относят фильтрование к механическим способам стерилизации.

Методом фильтрования стерилизуют питательные среды, содержащие белок, сыворотки, некоторые антибиотики, а также отделяют бактерии от вирусов, фагов и экзотоксинов.

В микробиологической практике используют асбестовые фильтры Зейтца, мембранные фильтры и фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда.

Фильтры Зейтца представляют собой диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Толщина их 3-5 мм, диаметр 35-140 мм. Отечественная промышленность изготовляет фильтры двух марок: "Ф" (фильтрующие)- задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии; "СФ" (стерилизующие) - с меньшими порами, задерживающие бактерии, но пропускающие вирусы. Мятые асбестовые пластинки, а также пластинки с надломами и трещинами для работы непригодны.

Мембранные фильтры готовят из нитроцеллюлозы. Они представляют собой диски белого цвета толщиной 0,1 мм и диаметром 35 мм. В зависимости от размера пор их обозначают № 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 3).

Для стерилизации наиболее пригоден фильтр № 1. Кроме перечисленных, выпускают еще так называемый предварительный фильтр, предназначенный для освобождения фильтруемой жидкости от содержащихся в ней крупных частиц.

Фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда представляют собой полые цилиндры, закрытые с одного конца. Свечи Шамберлана изготовляют из каолина с примесью песка и кварца. Стандартизуют их по размерам пор и обозначают L 1 , L 2 , L 3 ... L 13 . Фильтры (свечи) Беркефельда готовят из инфузорной земли, по величине пор их обозначают V, N, W, что соответствует диаметру пор 3-4, 4-7, 8-12 мк.

Работу с бактериальными фильтрами осуществляют следующим образом. Фильтр должен быть закреплен в специальном держателе, который вставляют в приемник фильтра. Приемником обычно является колба Бунзена. Держатели, в большинстве случаев сделанные из нержавеющей стали, состоят из двух частей: верхней, имеющей форму цилиндра без дна, и нижней - опорной части, заканчивающейся трубкой. Фильтры Зейтца шероховатой поверхностью вверх помещают на металлическую сетку и крепко зажимают винтами между верхней и нижней частью держателя. Смонтированный фильтр укрепляют в резиновой пробке, вставленной в горлышко колбы Бунзена. В отводную трубку колбы, которую присоединяют к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Подготовленную установку обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм в течение 20-30 мин. Весь прибор в собранном виде называют также фильтром Зейтца (рис. 13).

Непосредственно перед фильтрованием отводной конец колбы Бунзена соединяют резиновой трубкой с масляным или водоструйным насосом. Места соединения различных частей заливают парафином для создания герметичности. В цилиндр аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в приемнике. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник, а микробы остаются на поверхности фильтра.

Мембранные фильтры перед употреблением стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Чтобы предупредить скручивание фильтров, их сначала помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60° С, и кипятят на слабом огне 30 мин, 2-3 раза меняя воду. Держатель и приемник фильтра стерилизуют заранее, прибор монтируют в асептических условиях. Чтобы не порвать мембранный фильтр о металлическую сетку, под него кладут кружки стерильной фильтровальной бумаги. Затем стерильным пинцетом с гладкими кончиками берут мембранный фильтр из стерилизатора и помещают на опорную сетку блестящей поверхностью вниз.

Простерилизованные в автоклаве свечи (Шамберлана) соединяют посредством резиновой трубки с приёмником и опускают в сосуд (чаще цилиндр) с фильтруемой жидкостью. Фильтрация происходит при помощи вакуумного насоса. В приемник поступает стерильный фильтрат, а бактерии задерживаются порами свечи.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после употребления кипятят в водопроводной воде, затем прокаливают в муфельной печи.

Перед последующим употреблением свечи проверяют на целостность. Свечу опускают в сосуд с водой и пропускают воздух. Если на поверхности свечи выступают пузырьки воздуха, значит в свече образовались трещины и она непригодна.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается метод стерилизации фильтрованием? Что стерилизуют этим методом?

2. Какие бактериальные фильтры Вы знаете? Как монтируют прибор для фильтрования, какие условия необходимо соблюдать?

Химические способы

Этот вид стерилизации применяют ограниченно, и он служит в основном для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток).

К питательным средам чаще всего прибавляют такие вещества, как хлороформ, толуол, эфир. При необходимости освободить среду от этих консервантов ее нагревают на водяной бане при 56° С (консерванты испаряются).

Для консервирования вакцин, сывороток пользуются мертиолатом, борной кислотой, формалином и т. д.

Биологическая стерилизация

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. Этот метод используют при культивировании вирусов.

Контрольные вопросы

1. Что такое химическая стерилизация и когда ее используют?

2. Что такое биологическая стерилизация?

Основные способы стерилизации представлены в табл. 4.

1 (Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются споры. )

2 (Стерилизация неполная: в стерилизуемом материале сохраняются вирусы. )

Дезинфекция

В микробиологической практике применяют различные дезинфицирующие вещества: 3-5% растворы фенола, 5-10% растворы лизола, 1-5% растворы хлорамина, 3-6% растворы перекиси водорода, 1-5% растворы формалина, растворы сулемы в разведении 1:1000 (0,1%), 70° спирт и др.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (гной, кал, моча, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость) перед сливом его в канализацию. Обеззараживание проводят сухой хлорной известью или 3-5% раствором хлорамина.

Загрязненные патологическим материалом или культурами микроорганизмов пипетки (градуированные и пастеровские), стеклянные шпатели, предметные и покровные стекла опускают на сутки в стеклянные банки с 3% раствором фенола или перекиси водорода.

По окончании работы с заразным материалом лаборант должен обработать дезинфицирующим раствором рабочее место и руки. Поверхность рабочего стола протирают кусочком ваты, смоченным 3% раствором фенола. Руки дезинфицируют 1% раствором хлорамина. Для этого ватный шарик или марлевую салфетку смачивают дезинфицирующим раствором и протирают левую кисть, потом правую, а затем моют руки теплой водой с мылом.

Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация и длительность воздействия (экспозиция) зависят от биологических свойств микроба и от той среды, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с патогенными микроорганизмами. Например, сулема, фенол, спирты непригодны для обеззараживания белковых субстратов (гной, кровь, мокрота), так как под их влиянием происходит свертывание белков, а свернувшийся белок предохраняет микроорганизмы от воздействия дезинфицирующих веществ.

При дезинфекции материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов, применяют 5% раствор хлорамина, 1-2,5% растворы активированного хлорамина, 5-10% растворы формалина и другие вещества.

Дезинфекцию, которую проводят на протяжении всего дня по ходу работы, называют текущей, а по окончании работы - заключительной.

Дезинфицирующие вещества и прописи приготовления из них рабочих растворов . Хлорная известь - белый комковатый порошок с резким запахом хлора, в воде растворяется не полностью. Бактерицидный эффект зависит от содержания активного хлора, количество которого колеблется от 28 до 36%. Хлорная известь, содержащая менее 25% активного хлора, для дезинфекции непригодна.

При неправильном хранении хлорная известь разлагается и теряет часть активного хлора. Разложению способствуют тепло, влага, солнечный свет, поэтому хранить хлорную известь следует в сухом, темном месте, в плотно закрытой таре.

Сухую хлорную известь применяют для обеззараживания выделений человека и животных (из расчета 200 г на 1 л испражнений и 10 г на 1 л мочи).

Приготовление исходного 10% осветленного раствора хлорной извести. Берут 1 кг сухой хлорной извести, помещают в эмалированное ведро и измельчают. Затем заливают холодной водой до объема 10 л, хорошо перемешивают, закрывают крышкой и оставляют на сутки в прохладном месте. После этого образовавшийся 10% осветленный раствор осторожно сливают и отфильтровывают через несколько слоев марли или процеживают через плотную ткань. Хранят в бутылях из темного стекла, закрытых деревянной пробкой, в прохладном месте, не более 10 сут. Рабочие растворы необходимой концентрации готовят из основного раствора непосредственного перед их употреблением. Количество основного раствора, необходимое для приготовления 0,2-10% осветленных растворов хлорной извести, приведено в табл. 5.

Концентрацию осветленных растворов хлорной извести от 0,2 до 10% выбирают в зависимости от характера обеззараживаемого объекта и устойчивости возбудителя.

Хлорамин - кристаллическое вещество белого или желтоватого цвета, содержит 24-28% активного хлора. Хорошо растворяется в воде при комнатной температуре, поэтому растворы его готовят непосредственно перед дезинфекцией. Пользуются 0,2-10% растворами хлорамина. Соотношение между процентной концентрацией раствора и количеством хлорамина в граммах на 1 и 10 л приведено в табл. 6.

Растворяют хлорамин в стеклянной или эмалированной посуде. При хранении растворов хлорамина в посуде из темного стекла с притертой пробкой их активность сохраняется до 15 сут.

Активированный хлорамин. Дезинфицирующие свойства хлорамина усиливаются при добавлении к нему активатора в соотношении 1:1 или 1:2. В качестве активатора используют аммонийные соединения - хлорид, сульфат, нитрат аммония. Применяется активированный хлорамин в концентрации 0,5, 1 и 2,5%. Готовят их непосредственно перед употреблением. Раздельно отвешивают хлорамин и соль аммония. Сначала растворяют в воде хлорамин, а затем прибавляют активатор.

Преимущество активированных растворов хлорамина перед обычными заключается в том, что при добавлении активатора ускоряется выделение активного хлора. Поэтому препарат губительно действует не только на вегетативные формы микроорганизмов, но и на их споры. Активированный хлорамин применяют в более низких концентрациях и при меньшей экспозиции.

Фенол (карболовая кислота) представляет собой бесцветные кристаллы игольчатой формы с резким характерным запахом. Под действием света, воздуха и влаги кристаллы приобретают малиново-красный цвет. Хранят в закрытых банках из темного стекла и в защищенном от света месте.

Фенол растворим в воде, спирте, эфире, жирных маслах. Обладая большой гигроскопичностью, поглощает из окружающей среды влагу и становится жидким. Жидкая карболовая кислота содержит 90% кристаллического фенола и 10% воды.

Применяют 3-5% водные растворы карболовой кислоты, приготовленные из кристаллического фенола и жидкой карболовой кислоты по схеме, приведенной в табл. 7. Активность фенола повышается при растворении его в горячей воде (40-50° С).

Внимание! Кристаллический фенол или жидкая карболовая кислота, попадая на кожу, могут вызвать ее раздражение, а в больших концентрациях - тяжелые ожоги. Поэтому обращаться с карболовой кислотой нужно с большой осторожностью. При изготовлении растворов следует надевать резиновые перчатки или в крайнем случае смазать руки вазелином.

В случае попадания карболовой кислоты на кожу необходимо немедленно смыть ее теплой водой с мылом или 40° этиловым спиртом.

Примечание. Для приготовления дезинфицирующих растворов фенола удобнее и безопаснее использовать жидкую карболовую кислоту.

Контрольные вопросы

1. Какие дезинфицирующие вещества применяют в микробиологической практике?

2. Опишите внешний вид и основные свойства хлорной извести, хлорамина, фенола.

3. Какие растворы дезинфицирующих веществ используют для обеззараживания материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов?

Задание

Приготовьте 2 л 5% рабочего раствора осветленной хлорной извести; 500 мл 3% раствора хлорамина, 300 мл 1% раствора активированного хлорамина.

Внимание! Прежде чем приступить к приготовлению растворов, сделайте расчеты.

Изменение условий внешней среды оказывает воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Физические, химические, биологические факторы среды могут ускорять или подавлять развитие микробов, могут изменять их свойства или даже вызывать гибель.

К факторам среды, оказывающим наиболее заметное действие на , относятся влажность, температура, кислотность и химический состав среды, действие света и других физических факторов.

Влажность

Микроорганизмы могут жить и развиваться только в среде с определенным содержанием влаги. Вода необходима для всех процессов обмена веществ микроорганизмов, для нормального осмотического давления в микробной клетке, для сохранения ее жизнеспособности. У различных микроорганизмов потребность в воде не одинакова. Бактерии относятся в основном к влаголюбивым, при влажности среды ниже 20 % их рост прекращается. Для плесеней нижний предел влажности среды составляет 15%, а при значительной влажности воздуха и ниже. Оседание водяных паров из воздуха на поверхность продукта способствует размножению микроорганизмов.

При снижении содержания воды в среде рост микроорганизмов замедляется и может совсем прекращаться. Поэтому сухие продукты могут храниться значительно дольше продуктов с высокой влажностью. Сушка продуктов позволяет сохранять продукты при комнатной температуре без охлаждения.

Некоторые микробы очень устойчивы к высушиванию, некоторые бактерии и дрожжи в высушенном состоянии могут сохраняться до месяца и более. Споры бактерий и плесневых грибов сохраняют жизнеспособность при отсутствии влаги десятки, а иногда и сотни лет.

Температура

Температура — важнейший фактор для развития микроорганизмов. Для каждого из микроорганизмов существует минимум, оптимум и максимум температурного режима для роста. По этому свойству микробы подразделяются на три группы:

• психрофилы - микроорганизмы, хорошо растущие при низких температурах с минимумом при -10-0 °С, оптимумом при 10-15 °С;
• мезофилы - микроорганизмы, для которых оптимум роста наблюдается при 25-35 °С, минимум — при 5-10 °С, максимум — при 50-60 °С;
• термофилы - микроорганизмы, хорошо растущие при относительно высоких температурах с оптимумом роста при 50-65 °С, максимумом — при температуре более 70 °С.

Большинство микроорганизмов относится к мезофилам, для развития которых оптимальной является температура 25-35 °С. Поэтому хранение пищевых продуктов при такой температуре приводит к быстрому размножению в них микроорганизмов и порче продуктов. Некоторые микробы при значительном накоплении в продуктах способны привести к пищевым отравлениям человека. Патогенные микроорганизмы, т.е. вызывающие инфекционные заболевания человека, также относятся к мезофилам.

Низкие температуры замедляют рост микроорганизмов, но не убивают их. В охлажденных пищевых продуктах рост микроорганизмов замедленно, но продолжается. При температуре ниже О °С большинство микробов прекращают размножаться, т.е. при замораживании продуктов рост микробов останавливается, некоторые из них постепенно отмирают. Установлено, что при температуре ниже О °С большинство микроорганизмов впадают в состояние, похожее на анабиоз, сохраняют свою жизнеспособность и при повышении температуры продолжают свое развитие. Это свойство микроорганизмов следует учитывать при хранении и дальнейшей кулинарной обработке пищевых продуктов. Например, в замороженном мясе могут длительно сохраняться сальмонеллы, а после размораживания мяса они в благоприятных условиях быстро накапливаются до опасного для человека количества.

При воздействии высокой температуры, превышающей максимум выносливости микроорганизмов, происходит их отмирание. Бактерии, не обладающие способностью образовывать споры, погибают при нагревании во влажной среде до 60-70 °С через 15-30 мин, до 80-100 °С — через несколько секунд или минут. У спор бактерий термоустойчивость значительно выше. Они способны выдерживать 100 °С в течение 1-6 ч, при температуре 120-130 °С споры бактерий во влажной среде погибают через 20-30 мин. Споры плесеней менее термостойки.

Тепловая кулинарная обработка пищевых продуктов в общественном питании, пастеризация и стерилизация продуктов в пищевой промышленности приводят к частичной или полной (стерилизация) гибели вегетативных клеток микроорганизмов.

При пастеризации пищевой продукт подвергается минимальному температурному воздействию. В зависимости от температурного режима различают низкую и высокую пастеризацию.

Низкая пастеризация проводится при температуре, не превышающей 65-80 °С, не менее 20 мин для большей гарантии безопасности продукта.

Высокая пастеризация представляет собой кратковременное (не более 1 мин) воздействие на пастеризуемый продукт температуры выше 90 °С, которая приводит к гибели патогенной неспороносной микрофлоры и в то же время не влечет за собой существенных изменений природных свойств пастеризуемых продуктов. Пастеризованные продукты не могут храниться без холода.

Стерилизация предусматривает освобождение продукта от всех форм микроорганизмов, в том числе и спор. Стерилизация баночных консервов проводится в специальных устройствах — автоклавах (под давлением пара) при температуре 110-125°С в течение 20-60 мин. Стерилизация обеспечивает возможность длительного хранения консервов. Молоко стерилизуется метолом ультравысокотемпературной обработки (при температуре выше 130 °С) в течение нескольких секунд, что позволяет сохранить все полезные свойства молока.

Реакция среды

Жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации водородных (Н +) или гидроксильных (ОН -) ионов в субстрате, на котором они развиваются. Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная (рН около 7) или слабощелочная среда. Плесневые грибы и дрожжи хорошо растут при слабокислой реакции среды. Высокая кислотность среды (рН ниже 4,0) препятствует развитию бактерий, однако плесени могут продолжать расти и в более кислой среде. Подавление роста гнилостных микроорганизмов при подкислении среды имеет практическое применение. Добавление уксусной кислоты используется при мариновании продуктов, что препятствует процессам гниения и позволяет сохранить продукты. Образующаяся при квашении молочная кислота также подавляет рост гнилостных бактерий.

Концентрация соли и сахара

Поваренная соль и сахар издавна используются для повышения стойкости продуктов к микробной порче и лучшей сохранности пищевых продуктов.

Некоторые микроорганизмы нуждаются для своего развития в высоких концентрациях соли (20 % и выше). Их называют солелюбивыми, или галофилами. Они могут вызывать порчу соленых продуктов.

Высокие концентрации сахара (выше 55-65 %) прекращают размножение большинства микроорганизмов, это используется при приготовлении из плодов и ягод варенья, джема или повидла. Однако эти продукты тоже могут подвергаться порче в результате размножения осмофильных плесеней или дрожжей.

Свет

Некоторым микроорганизмам свет необходим для нормального развития, но для большинства из них он губителен. Ультрафиолетовые лучи солнца обладают бактерицидным действием, т. е. при определенных дозах облучения приводят к гибели микроорганизмов. Бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей ртутно-кварцевых ламп используют для дезинфекции воздуха, воды, некоторых пищевых продуктов. Инфракрасные лучи тоже могут вызвать гибель микробов за счет теплового воздействия. Воздействие этих лучей применяют при тепловой обработке продуктов. Негативное воздействие на микроорганизмы могут оказывать электромагнитные поля, ионизирующие излучения и другие физические факторы среды.

Химические факторы

Некоторые химические вещества способны оказывать на микроорганизмы губительное действие. Химические вещества, обладающие бактерицидным действием, называют антисептиками. К ним относятся дезинфицирующие средства (хлорная известь, гипохлориты и др.), используемые в медицине, на предприятиях пищевой промышленности и общественного питания.

Некоторые антисептики применяются в качестве пищевых добавок (сорбиновая и бензойная кислоты и др.) при изготовлении соков, икры, кремов, салатов и других продуктов.

Биологические факторы

Антагонистические свойства некоторых объясняются способностью их выделять в окружающую среду вещества, обладающие антимикробным (бактериостатическим, бактерицидным или фунгицидным) действием, - антибиотики. Антибиотики продуцируются в основном грибами, реже бактериями, они оказывают свое специфическое действие на определенные виды бактерий или грибов (фунгицидное действие). Антибиотики применяются в медицине (пенициллин, левомицетин, стрептомицин и др.), в животноводстве в качестве кормовой добавки, в пищевой промышленности для консервирования пищевых продуктов (низин).

Антибиотическими свойствами обладают фитонциды — вещества, обнаруженные во многих растениях и пищевых продуктах (лук, чеснок, редька, хрен, пряности и др.). К фитонцидам относятся эфирные масла, антоцианы и другие вещества. Они способны вызывать гибель патогенных микроорганизмов и гнилостных бактерий.

В яичном белке, рыбной икре, слезах, слюне содержится лизоцим — антибиотическое вещество животного происхождения.

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени »

_____________________________________________________

Влияние физических, химических и биологических факторов

на микроорганизмы

Москва – 2011

Грязнева физических, химических и био­логических факторов на микроорганизмы /Лекция.- М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ.- 20с.

Предназначена для студентов высших учебных заве­де­ний по специальностям 111801 - «Ветеринария», 020207 - «Биофизика», 020208 - «Биохимия», 110501 – «Ветсан­экс­пертиза», 080– «Товароведение и экспер­тиза товаров», 111100 – «Зоотехния».

Рецензенты:

доктор ветеринарных наук, профессор

Утверждены учебно-методической и клинической ко­мис­сией факуль­тета ве­теринарной медицины ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол от 21 марта 2011 г.).

Влияние физических, химических и биологических факторов на микроорганизмы

Введение.

1. Физические факторы, влияющие на микроорганизмы.

2. Химические факторы.

3. Биологические факторы.

4. Стерилизация.

5. Приспособляемость микроорганизмов к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Заключение.

Вопросы для самоконтроля

Литература

1. , Бурла-кова Г. И., Шайкова подготовка студентов по дисциплине «Микробиология» с тестовыми заданиями: Учебное пособие.– М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008.

2. , Родионова //Методи-ческие рекомендации по изучению дисциплины и выполнению самостоятельной работы для студентов факультета ветеринар-ной медицины очного, заочного и очно-заочного обучения.- М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ.- 2008.

3. , Госманов микробио­логия и иммунология : Учебник.- М.: КолосС.- 2006.

4. , Скородумов ­тикум по ветеринарной микробиологии.- М.: КолосС.- 2008.

5. Поздеев микробиология: Учебник для ву­зов.- М.: Геотар-Мед.- 2001.

6. , Банникова морфо­логии популяций патогенных бактерий.- М.: Колос. 2007.

Введение

Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий окружающей среды, поэтому микроорганизмы должны по­стоянно к ней приспосабливаться.

Как на человека, животных и растения, так и на микроорга­низмы существенное влияние оказывают различные факторы внешней среды. Их можно разделить на три группы: физические, химические и биологические.

Результаты действия факторов внешней среды на микроорга­низмы:

1. Благоприятные.

2. Неблагоприятные (бактериостатическое и бактерицидное действие).

3. Изменяющие свойства микроорганизмов.

4. Индифферентные.

Антимикробные факторы окружающей среды используются при стерилизации , дезинфекции, лечении, соблюдении правил асеп­тики и антисептики и др.

1. Физические факторы, влияющие на микроорганизмы

Из физических факторов наибольшее влияние на микроорга­низмы оказывают:

1. Температура.

2. Высушивание (лиофильная сушка).

3. Лучистая энергия (СВЧ-энергия, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация).

4. Ультразвук.

5. Давление (атмосферное, гидростатическое, осмотическое).

6. Электричество.

7. Кислотность среды (рН среды).

8. Наличие кислорода.

9. Влажность и вязкость среды обитания.

Температура - один из самых мощных факторов воздействия на микроорганизмы. Они или выживают, или погибают, или при­спосабливаются и растут.

Последствия влияния температуры на бактерии:

1. Способность микроорганизмов к выживанию после длитель­ного нахождения в экстремальных температурных условиях.

2. Способность микроорганизмов к росту в экстремальных тем­пературных условиях.

Жизнедеятельность каждого микроорганизма ограничена оп­ределенными температурными границами.

Эту температурную зависимость обычно выражают тремя точ­ками:

§ минимальная (min) температура - ниже которой размножение прекращается;

§ оптимальная (opt) температура - наилучшая температура для роста и развития микроорганизмов;

§ максимальная (max) температура - температура, при которой рост клеток или замедляется, или прекращается совсем.

Оптимальная температура обычно приравнивается к темпера­туре окружающей среды.

Все микроорганизмы по отношению к температуре условно можно разделить на 3 группы: психрофилы, мезофиллы, термо­филы.

Сапрофиты

Иерсинии

Псевдомонады

Клебсиеллы

Листерии и др.

Оптимальная температура роста и размножения психрофилов

Психрофилы - это холодолюбивые микроорганизмы, растут при низких температурах: min t - 0°С, opt t - от 10-20°С, max t - до 35°С. К таким микроорганизмам относятся обитатели северных морей и водоемов , а также некоторые патогенные бактерии - возбудители иерсиниоза, псевдомоноза, клебсиеллеза, листериоза и др.

К действию низких температур многие микроорганизмы очень устойчивы. Например, листерии, холерный вибрион, некоторые виды синегнойной палочки (Pseudomonas аtrobacter) долго могут храниться во льду, не утратив при этом своей жизнеспособности.

Некоторые микроорганизмы выдерживают температуру до ми­нус 190°С, а споры бактерий могут выдерживать до минус 250°С. Действие низких температур приостанавливает гнилостные и бро­дильные процессы, поэтому в быту мы пользуемся холодильни­ками.

При низких температурах микроорганизмы впадают в состоя­ние анабиоза, при котором замедляются все процессы жизнедея­тельности, протекающие в клетке. Однако, многие из психрофилов способны быстро вызывать микробиальную порчу пищевых про­дуктов и кормов, хранящихся при 0°С.

Большинство па­тогенных и ус­ловно-патогенных микроорганизмов

Оптимальная температура роста и размножения мезофилов

Мезофилы - это наиболее обширная группа бактерий, в кото­рую входят сапрофиты и почти все патогенные микроорганизмы, так как opt температура для них 37°С (температура тела), min t - 10°С, max t - 50°C.

Термофилы - теплолюбивые бактерии, развиваются при тем­пературе выше 55°С, min t для них - 40°С, max t – до 100°С. Эти микроорганизмы обитают в основном в горячих источниках. Среди термофилов встречается много споровых форм (В. stearothermo-philus. В. aerothermophilus) и анаэробов.

https://pandia.ru/text/78/203/images/image006_13.jpg" width="335 height=140" height="140">

Вегетативные формы Споры

Температурные диапазоны гибели микроорганизмов

Споры бактерий гораздо устойчивей к высоким температурам, чем вегетативные формы бактерий. Например, споры бацилл си­бирской язвы выдерживают кипячение в течение 2 часов.

Все микроорганизмы, включая и споровые, погибают при тем­пературе 165-170°С в течение 1 часа.

Действие высоких температур на микроорганизмы положено в основу стерилизации.

Высушивание . Для нормальной жизнедеятельности микроор­ганизмов нужна вода. Высушивание приводит к обезвоживанию цитоплазмы и нарушается целостность цитоплазматической мем­браны, что ведет к гибели клетки.

Некоторые микроорганизмы (многие виды кокков) под влия­нием высушивания погибают уже через несколько минут.

Более устойчивыми к высушиванию являются возбудители ту­беркулеза, которые могут сохранять свою жизнеспособность до 9 месяцев, а также капсульные формы бактерий.

Особенно устойчивыми к высушиванию являются споры. На­пример, споры возбудителя сибирской язвы могут сохраняться в почве более 100 лет.

Для хранения микроорганизмов в музеях микробных культур и изготовления сухих вакцинных препаратов из бактерий применя­ется метод лиофильной сушки.

Сущность метода состоит в том, что в аппаратах для лиофиль­ной сушки – лиофилизаторах микроорганизмы сначала заморажи­вают, а потом высушивают при положительной температуре в ус­ловиях вакуума . При этом цитоплазма бактерий замерзает и пре­вращается в лед, а потом этот лед испаряется и клетка остается жива (переход воды из замороженного состояния в газообразное, минуя жидкую фазу - сублимация ).

Замороженные бактерии (I этап лиофильного высушивания)

Образование внеклеточного (а) и внутриклеточного (б) льда при лиофильном высушивании бактерий

Лиофильно высушенные диплококки

При правильном лиофильном высушивании микробные клетки переходят в состояние анабиоза и сохраняют свои биологические свойства в течение нескольких лет.

Лифильно высушенные живая (а) и погибшая (б) бактерии

Если режим лиофильного высушивания не соблюдался (а для разных видов бактерий он различен), то клеточная стенка у бакте­рий разрывается и они гибнут.

Лучистая энергия . Существуют разные формы лучистой энер­гии, характеризующиеся различными свойствами, силой и харак­тером действия на микроорганизмы.

В природе бактериальные клетки постоянно подвергаются воз­действию солнечной радиации.

Прямые солнечные лучи губительно действуют на микроорга­низмы. Это относится к ультрафиолетовому спектру солнечного света (УФ-лучи).

Вследствие присущей УФ-лучам высокой химической и биоло­гической активности, они вызывают у микроорганизмов инактива­цию ферментов, коагуляцию белков, разрушают ДНК в результате чего наступает гибель клетки. При этом обеззараживается только поверхность облученных объектов из-за низкой проникающей спо­собности этих лучей.

Патогенные бактерии более чувствительны к действию УФ-лу­чей, чем сапрофиты, поэтому в бактериологической лаборатории микроорганизмы выращивают и хранят в темноте.

Опыт Бухнера показывает, насколько УФ-лучи губительно дей­ствуют на бактерии: чашку Петри с плотной средой засевают сплошным газоном. Часть посева накрывают бумагой, и ставят чашку Петри на солнце, а затем через некоторое время (15-30 мин) ее ставят в термостат.

Прорастают только те микроорганизмы, которые находились под бумагой. Поэтому значение солнечного света для обеззараживания ок­ружающей среды очень велико.

Используемые для этих целей приборы, испускающие ультра­звук, называют ультразвуковыми дезинтеграторами (УЗД).

Высокое давление . К высокому атмосферному или гидроста­тическому давлению бактерии, а особенно споры, очень устой­чивы (барофильные микроорганизмы). В природе встречаются бактерии, которые живут в морях и океанах на глубине м под давлением от 100 до 900 атм. Эти бактерии являются са­профитными и относятся к археям.

Бактерии переносят давление атм, а споры бакте­рий - до 20000 атм. При таком высоком давлении снижается ак­тивность бактериальных ферментов и токсинов.

Сочетанное действие повышенных температур и повышенного давления используется в паровых стерилизаторах (автоклавах) для стерилизации паром под давлением.

Важным фактором является внутриклеточное осмотическое давление у различных микроорганизмов.

Влияние осмотического давления на микробную клетку:

1. Плазмолиз (потеря воды и гибель клетки) происходит с мик­роорганизмами, если их помещают в среду с более высоким осмо­тическим давлением.

2. Плазмоптиз (поступление воды в клетку и разрыв клеточной стенки) – происходит с микроорганизмами при перемещении их в среду с низким осмотическим давлением.

https://pandia.ru/text/78/203/images/image034.jpg" width="219" height="142">Водород" href="/text/category/vodorod/" rel="bookmark">водородных ионов.

Для ацидофилов оптимальная для жизни рН -6,0-7,0; для алка­лофилов - 9,0-10,0; для нейтралофилов - 7,5.

Значение рН оказывает существенное влияние на синтез того или иного метаболита.

В ряде случаев оптимум для роста культуры и образования продукта неодинаков. С увеличением температуры культивирова­ния диапозон переносимых значений рН сужается.

Вязкость среды определяет диффузию питательных веществ из объема среды к поверхности клетки.

2. Химические факторы

Известно, что изменение состава и концентрации питательных элементов питательной среды может затормозить, прекратить или стимулировать процессы роста и размножения бактериальной по­пуляции. Следовательно, химические факторы способны влиять на жизнедеятельность микроорганизмов.

Степень воздействия химического агента на микроорганизм может быть различной. Она зависит от химического соединения, его концентрации, продолжительности воздействия, а так же от индивидуальных свойств микроорганизма.

Бактериостатическое действие регистрируется в том случае, если химическое вещество подавляет размножение бактерий, а после его удаления процесс размножения восстанавливается.

Бактерицидное действие вызывает необратимую гибель мик­роорганизмов.

Некоторые химические вещества безразличны для бактерий, другие могут стимулировать процессы их развития или являться питанием для бактерий. Например, соль NaCl в малых количест­вах добавляют в питательные среды.

Химические вещества, способные оказывать бактерицидное действие на разные группы микроорганизмов, используют для де­зинфекции.

Дезинфекция (уничтожение инфекции, обеззараживание объ­ектов окружающей среды) – это комплекс мероприятий, направ­ленный на уничтожение возбудителей инфекционных болезней в окружающей среде.

Другими словами, дезинфекция – это уничтожение патогенных микроорганизмов во внешней среде с помощью химических ве­ществ, обладающих антимикробным действием.

К химическим веществам, действующим на микроорганизмы относятся:

1. Окислители.

2. Поверхностно-активные вещества.

3. Галогены.

4. Соли тяжелых металлов.

5. Кислоты.

6. Щелочи.

7. Спирты.

8. Фенолы, крезолы и их производные.

9. Альдегиды (формальдегид, формалин).

10. Красители.

По механизму противомикробного действия все химические вещества подразделяются на 5 классов :

1. Денатурирующие белки – коагулируют и свертывают белки.

2. Омыляющие белки – приводят к набуханию и растворению белков.

3. Окисляющие белки - повреждают сульфгидрильные группы активных белков.

4. Реагирующие с фосфатнокислыми группами нуклеиновых кислот.

5. Поверхностно активные вещества - вызывают повреждения клеточной стенки.

Денатурирующие вещества :

§ фенол, крезол и их производные - бактерицидное действие связано с повреждением клеточной стенки и денатурацией белков цитоплазмы;

§ формальдегид - бактерицидное действие обусловлено дегид­ратацией поверхностных слоев и денатурацией белка;

§ спирты - бактерицидное действие обусловлено способностью отнимать воду и свертывать белки;

§ соли тяжелых металлов (сулема, мертиолат, соли ртути, се­ребра, цинка, свинца, меди) - положительно заряженные ионы ме­таллов адсорбируются на отрицательно заряженной поверхности бактерий и изменяют проницаемость их цитоплазматической мем­браны, при этом изменяется структура дыхательных ферментов и разобщаются процессы окисления и фосфорилирования в мито­хондриях.

Омыляющие белки – щелочи, гашеная известь.

Окисляющие белки (хлор, бром, йодосодержащие, перекись водорода, перманганат калия) - выделяют активный атомарный кислород, вызывая цепную реакцию свободнорадикального пере­кисного окисления липидов, что ведет к деструкции мембран и белков микроорганизмов.

Поверхностно-активные вещества (жирные кислоты, мыла, моющие средства , детергенты) - изменяют энергетическое соот­ношение поверхности микробной клетки (заряд с отрицательного меняется на положительный), что нарушает проницаемость и ос­мотическое равновесие.

Галогены (хлорсодержащие: хлорная известь, хлорамин Б, ди­хлор-1, сульфохлорантин, хлорцин и др.; йодосодержащие: спир­товый раствор йода, йодинол, йодоформ, раствор Люголя и др.) – разрушают ферментативные структуры бактериальной клетки, уг­нетают гидролитическую и дегидрогеназную активность бактерий, инактивируют такие ферменты, как амилазы и протеазы, денату­рируют белки цитоплазмы, а также выделяют атомарный кисло­род, оказывающий окисляющее действие на микроорганизмы.

Красители (бриллиантовый зеленый, риванол, трипофлавин, метиленовая синь) - обладают сродством к фосфорно-кислым гру-ппам нуклеиновых кислот и нарушают процесс деления бактерий. Многие красители используются в составе антисептиков.

Бактерицидный эффект кислот (салициловая, борная) и ще­лочей (едкий натр) на микроорганизмы обуславливается:

§ дегидратацией микроорганизмов;

§ изменением рН среды;

§ образованием кислотных и щелочных альбуминатов .

Новое поколение дезинфицирующих средств – четвертичные аммонийные соединения (ЧАС) и их соли.

Одним из наиболее эффективных дезинфицирующих средств на сегодняшний день является Велтолен - жидкий концентрат на основе уникальной отечественной, запатентованной субстанции «Велтон» (клатрат ЧАС с карбамидом).

Велтолен оказывает бактерицидное, фунгицидное, спорули­цидное и вирулицидное действие в невысоких концентрациях, безвреден для животных и человека, экологически безопасен.

Механизмы противомикробного действия Велтолена

Антимикробное действие 0,5%-ного раствора Велтолена на возбудителя сибирской язвы B. аnthracis при экспозиция 5 мин. вы­зывает вакуолизацию цитоплазмы бактерий и отслоение клеточ­ной стенки.

на B .а nthracis при экспозиция 5 мин.

Антимикробное действие 0,5% раствора Велтолена на возбу­дителя сибирской при экспозиция 15 мин. вызывает отслоение клеточной стенки, ее разрыв и вакуолизацию цитоплазмы.

Антимикробное действие 0,5% раствора Велтолена

на B .а nthracis при экспозиция 15 мин.

Антимикробное действие 0,5% раствора Велтолена на возбу­дителя сибирской при экспозиция 60 мин. вызывает разрушение большей части бактериальных клеток с потерей клеточной стенки и выхода наружу клеточного детрита. Часть спор под действием Велтолена формирует миелиновые фигуры.

Антимикробное действие 0,5% раствора Велтолена

на B .а nthracis при экспозиция 60 мин.

Активность различных дезинфицирующих веществ не одина­кова и зависит от времени экспозиции, концентрации, темпера­туры дезинфицирующих растворов и окружающей среды.

Дезинфекция с помощью химических веществ в качестве со­ставляющей входит в совокупность мер, направленных на уничто­жение микроорганизмов не только в окружающей среде, но и в макроорганизме, например, в ране и является основой асептики и антисептики.

Асептика - это комплекс профилактических мероприятий, на­правленных на предупреждение попадания микроорганизмов в рану или организм человека и животного.

Антисептика - это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране или в организме в целом, на предупреждение и ликвидацию воспалительного процесса.

Антисептики - это противомикробные вещества, которые ис­пользуются для обеззараживания биологических поверхностей.

К антисептическим химическим веществам относятся краси­тели (метиленовый синий, бриллиантовый зеленый) - обладают денатурирующим и литическим эффектом, и производные 8-окси-хинолина (хинозол, нитроксалин, хинолон) и нитрофурана (фура­цилин, фуразолидон), которые нарушают биосинтетические и ферментативные процессы в бактериальной клетке.

3. Биологические факторы

К биологическим факторам , негативно воздействующим на микроорганизмы, можно отнести:

§ микроорганизмы-антагонисты;

§ пробиотики;

§ бактериофаги;

§ защитные факторы организма (клеточные и гуморальные).

Во внешней среде и в организме человека и животных обитает огромное количество разных видов микроорганизмов, которые по - разному взаимодействуют между собой.

Молочнокислые бактерии

Хищничество – нападение одного вида бактерии на другой с целью использование другого вида в качестве пищи.

https://pandia.ru/text/78/203/images/image049.jpg" width="302" height="201">

Bdellovibrio bacteriovorus проникает в сальмонеллу

Нейтрализм – микроорганизмы не оказывают друг на друга ни­какого влия­ния.

Наибольший интерес для науки и практики представляют раз­личные биологически активные вещества, образующиеся в про­цессе жизнедеятельности микроорганизмов, и одними их них яв­ляется антибиотики.

Антибиотики - продукты метаболизма живых организмов или их аналоги, получаемые синтетическим путем, способные избира­тельно подавлять рост микроорганизмов.

Термин "антибиотик" был предложен В. Вюименом в 1889 г., чтобы обозначить действующий агент процесса "антибиоза", т. е. сопротивления, оказываемого одним живым организмом другому.

В 1929 году А. Флемингом был открыт пенициллин, который в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде.

Механизм действия антибиотиков на бактерии

Классификация антибиотиков

«Феномен жемчужного ожерелья» у возбуди­теля сибирской язвы при выращивании его на пи­тательной среде с пени­циллином

В результате дейст­вия на B. аnthracis пени-циллина, у возбудителя разрушается клеточная стенка, образуются ша­ровидные протопласты, соединенные между собой в виде нитки бус.

Пенициллин способен вызвать разрушение клеточной стенки у многих видов бактерий. До недавнего времени к нему были осо­бенно чувствительны стафилококки и стрептококки.

У большинства грамотрицательных бактерий к пенициллину выработалась устойчивость, связанная с их способностью синте­зировать фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин.

https://pandia.ru/text/78/203/images/image055.jpg" width="204" height="169">.jpg" width="224" height="168">DIV_ADBLOCK169">

Возможные механизмы действия пробиотиков:

1. Подавление живых патогенных и условно-патогенных мик­роорганизмов.

а) продукция антибактериальных веществ - бактериоцинов;

б) конкуренция за источники питания;

в) конкуренция за рецепторы адгезии.

2. Влияние на микробный антагонизм.

а) уменьшение ферментативной активности;

б) увеличение ферментативной активности.

3. Стимуляция иммунитета.

б) увеличение активности макрофагов.

Пробиотические препараты, выпускаемые в странах –

членах ЕС и используемые в них виды микроорганизмов

Кроме перечисленных видов бактерий, в ряде стран в составе пробиотиков для животных используют Saccaharomyces cerevisiae, Candida pintolopesii, Aspergillus niger и Aspergillus ory­sae.

К молочнокислым бактериям, широко используемым для про­изводства пробиотиков, относятся молочнокислые стрептококки (S. lactis и S. cremoris) и лактобактерии (L. acidophilum, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricum).

Метаболиты молочнокислых бактерий и их регуляторные функции

В России чистые культуры молочнокислых бактерий стали применять с 1890 года. Большой вклад в разработку способов при­готовления чистых культур, сохранения их в сухом виде и исполь­зования в производстве кисломолочных продуктов внёсли и.

Сухожаровая стерилизация - проводится в печах Пастера (су­хожаровой шкаф). Это шкаф с двойными стенками, изготовленный из металла и асбеста, нагревающийся с помощью электричества и снабженный термометром. Сухим жаром стерилизуют, в основном, лабораторную посуду. Обеззараживание материала в нем проис­ходит при 160°С в течение 1 часа.

В бактериологических лабораториях используется такой вид стерилизации, как прокаливание над огнем (фломбирование) . Этот способ применяют для обеззараживания бактериологических пе­тель, шпателей, пипеток. Для прокаливания над огнем используют спиртовки или газовые горелки.

К физическим способам стерилизации относятся также УФ-лучи и рентгеновское излучение . Такую стерилизацию проводят в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдерживают вы­сокой температуры.

Тиндализация (двухступенчатая стерилизация) используется для обеззараживания материала, обсемененного спорами бакте­рий. При этом используется два режима нагревания материала – первый режим является оптимальным для прорастания спор и пе­рехода споровой формы бактерий в вегетативную, а второй режим направлен на уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов.

Механическая стерилизация (фильтрующая стерилизация) - проводится при помощи фильтров (керамических, стеклянных, ас­бестовых) и особенно мембранных ультрафильтров из коллоид­ных растворов нитроцеллюлозы.

Морфология" href="/text/category/morfologiya/" rel="bookmark">морфология (округление, удлинение клетки), куль­туральные свойства (стафилококки не образуют пигмент при не­достатке кислорода), биохимические или ферментативные свой­ства (выработка адаптивных ферментов у эшерихий - фермент лактаза на среде с лактозой). При фенотипической изменчивости кАк правило, через определенное время происходит возврат к ис­ходному состоянию («новый фенотип» утрачивается).

2. Генотипическая изменчивость (наследуемая) - возникает в результате мутаций и генетических рекомбинаций. При этом смена фенотипа связана с изменением генотипа и передается по на­следству. Нет возврата к исходному фенотипу.

Мутации (от лат. mutatio - изменять) - это стойко передаваемые по наследству структурные изменения генов, связанные с реорга­низацией нуклеотидов в молекуле ДНК. При мутациях изменяются участки геномов (т. е. наследственного аппарата).

Бактериальные мутации могут быть спонтанными (самопроиз­вольными) и индуцированными (направленными), т. е. появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутаге­нами (химическими веществами, температурой, излучением и т. д.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться:

§ изменение морфологических свойств микроорганизмов;

§ изменение культуральных свойств;

§ возникновение у микроорганизмов устойчивости к лекарствен­ным препаратам;

§ ослабление патогенных свойств и др.

К генетическим рекомбинациям относятся рекомбинации ге­нов, которые происходят вследствие трансформации, трансдукции и конъюгации.

Трансформация -передача генетического материала от бак­терии-донора бактерии-реципиенту при помощи изолированной ДНК другой клетки.

Бактерии, способные воспринимать ДНК другой клетки, назы­ваются компетентными.

Состояние компетентности часто совпадает с логарифмиче­ской фазой роста.

Для трансформации необходимо создавать особые условия, например, при добавлении в питательную среду неорганических фосфатов частота трансформации повышается.

Трансдукция - это перенос наследственного материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту бактериофагом.

Например, с помощью бактериофага можно воспроизвести трансдукцию жгутиков, ферментативные свойства, резистентность к антибиотикам, токсигенность и другие признаки.

Конъюгация - передача генетического материала от одной бактерии другой путем непосредственного контакта. Причем про­исходит односторонний перенос генетического материала - от до­нора реципиенту . Необходимым условием для конъюгации явля­ется наличие у донора цитоплазматической кольцевой молекулы ДНК - плазмиды и специфического фактора плодовитости F. У грамотрицательных бактерий обнаружены половые F-волоски, че­рез которые происходит перенос генетического материала. Клетки, играющие роль донора, обозначают F+, а реципиенты – F–-.

3. Промежуточная изменчивость - диссоциация. В однородной популяции бактерий появляются различные по биологическим свойствам клетки, образующие две формы колоний – R (шерохо­ватые, с рваными краями, часто связанные с приобретением бак­териями патогенных свойств) и S (круглые, гладкие, блестящие).

Заключение

На микроорганизмы во внешней среде воздействует огромное количество разнообразных неблагоприятных факторов, что за­ставляет их постоянно совершенствоваться, приспосабливаться и эволюционировать.

Именно неблагоприятные факторы внешней среды являются для микроорганизмов движущей силой видообразования.

Вопросы для самоконтроля

1. Результаты действия факторов внешней среды на микроорганизмы.

2. Какие физические факторы оказывают наибольшее влияние на микроорганизмы?

3. Каков температурный диапазон выращивания разных видов микроорганизмов?

4. В чем сущность лиофильного высушивания микроорганизмов?

5. Опишите опыт Бухнера.

6. Значение осмотического давления для бактерий.

7. На какие группы классифицируют микроорганизмы по отношению к концентрации водородных ионов в среде?

8. Что такое дезинфекция и дезинфектанты?

9. Классификация химических веществ по механизму противомикробного действия.

10. Какие средства называют антисептиками?

11. Перечислите биологические факторы, негативно воздействующие на микроорганизмы.

12. Какие взаимоотношения между бактериями обуславливает антагонистический симбиоз?

13. Каков механизм действия антибиотиков на бактерии?

14. Назовите возможные механизмы действия пробиотиков.

15. На какие группы подразделяют бактериофаги?

16. Что такое фильтрующая стерилизация?

17. Назовите отличия между фенотипической и генотипической изменчивостью бактерий.

Температура
По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на термофильные, психрофильные и мезофильные.

• Термофильные виды . Зона оптимального роста равна 50-60°С, верхняя зона задержки роста - 75°С. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена.
• Психрофильные виды (холодолюбивые) растут в диапазоне температур 0-10°С, максимальная зона задержки роста 20-30°С. К ним относит большинство сапрофитов, обитающих в почве, пресной и морской воде. Но есть некоторые виды, например, иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывающие заболевания у человека.
• Мезофильные виды лучше растут в пределах 20-40°С; максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются. К ним относится большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Высокая температура вызывает коагуляцию структурных белков и ферментов микроорганизмов. Большинство вегетативных форм гибнет при температуре 60°С в течение 30 мин, а при 80-100°С – через 1 мин. Споры бактерий устойчивы к температуре 100°С, гибнут при 130°С и более длительной экспозиции (до 2 ч.).
Для сохранения жизнеспособности относительно благоприятны низкие температуры (например, ниже 0°С), безвредные для большинства микробов. Бактерии выживают при температуре ниже –100°С; споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (до –250°С ).

Влажность
При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность большинства бактерий прекращается. Время их отмирания при высушивании различно (например, холерный вибрион – за 2 суток, а микобактерии – за 90 суток). Поэтому высушивание не используют как метод элиминации микробов с субстратов. Особой устойчивостью обладают споры бактерий.
Широко распространено искусственное высушивание микроорганизмов, или лиофилизация . Метод включает быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким (вакуумом) давлением (сухая возгонка). Лиофильную сушку применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток), а также для консервирования и длительного сохранения культур микроорганизмов.
Влияние концентрации растворов на рост микроорганизмов опосредовано изменением активности воды как меры доступной для организма воды. И если содержание солей вне клетки окажется выше их концентрации в клетке, то вода будет выходить из клетки. Угнетение патогенных бактерий хлористым натрием обычно начинается при его концентрации около 3% .

Излучения
Солнечный свет губительно действует на микроорганизмы, исключением являются фототрофные виды. Наибольший микробицидный эффект оказывает коротковолновые УФ-лучи. Энергию излучения используют для дезинфекции, а также для стерилизации термолабильных материалов.
УФ-лучи (в первую очередь коротковолновые, т.е. с длиной волны 250-270 нм) действуют на нуклеиновые кислоты. Микробицидное действие основано на разрыве водородных связей и образовании в молекуле ДНК димеров тимидина, приводящем к появлению нежизнеспособных мутантов. Применение УФ-излучения для стерилизации ограничено его низкой проницаемостью и высокой поглотительной активностью воды и стекла.
Рентгеновское и g-излучение в больших дозах также вызывает гибель микробов. Облучение вызывает образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микробных клеток. Применяют для стерилизации бактериологических препаратов, изделий из пластмасс.
Микроволновое излучение применяют для быстрой повторной стерилизации длительно хранящихся сред. Стерилизующий эффект достигается быстрым подъемом температуры.

Ультразвук
Определенные частоты ультразвука при искусственном воздействии способны вызывать деполимеризацию органелл микробных клеток, под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются и внутри клетки возникает высокое давление (до 10 000 атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

Давление
Бактерии относительно мало чувствительны к изменению гидростатического давления. Повышение давления до некоторого предела не сказывается на скорости роста обычных наземных бактерий, но в конце концов начинает препятствовать нормальному росту и делению. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3 000 – 5 000 атм, а бактериальные споры - даже 20 000 атм.
В условиях глубокого вакуума субстрат высыхает и жизнь невозможна.

Фильтрование
Для удаления микроорганизмов применяют различные материалы (мелкопористое стекло, целлюлоза, коалин); они обеспечивают эффективную элиминацию микроорганизмов из жидкостей и газов. Фильтрацию применяют для стерилизации жидкостей, чувствительных к температурным воздействиям, разделения микробов и их метаболитов (экзотоксинов, ферментов), а также для выделения вирусов.

ДЕЙСТВИЕ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Способность ряда химических веществ подавлять жизнедеятельность микроорганизмов зависит отконцентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект; химиотерапевтические средства проявляют избирательное противомикробное действие.

По механизму действия противомикробные вещества разделяются на:
а) деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки,
б) повышающие проницаемость клеточной мембраны,
в) блокирующие те или иные биохимические реакции,
г) денатурирующие ферменты,
д) окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов,
е) растворяющие липопротеиновые структуры,
ж) повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции.

У микроорганизмов химической деструкции прежде всего подвергаются белки и липиды цитоплазматической мембраны, белковые молекулы жгутиков, фимбрий, секс-пили, порины клеточной стенки грамположительных бактерий, связывающие белки периплазмы, протеиновые капсулы, экзотоксины, ферменты-токсины и ферменты питания. Деструкция гетерогенных полимеров (белки, полиэфиры и др.) происходит как при действии окислителей, так и при действии гидролизующих и детергентных антисептиков (кислоты, щелочи, соли двух- и поливалентных металлов и др.).

ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

К биологическим средстваммогут быть отнесены препараты, содержащие живых особей -бактериофагов и бактерий, обладающих выраженной конкурентной активностьюпо отношению к патогенным и условно-патогенным для человека и животных видам микробов . Они вводятся в организм в жизнеспособном состоянии. Фаги и антагонисты оказывают прямое повреждающее действие на патогенных и условно-патогенных микробов; изготовленные из них лекарственные препараты предназначены для местного применения, для них характерна специфичность действия на микроорганизмы и безвредность для пациента; целью их внесения в организм человека и животных является лечение или профилактика инфекционных заболеваний. По механизму действия они близки к химическим антисептикам.
Необходимо также помнить и о молочно -кислых бактериях, которые вызывают процесс молочно-кислого брожения. Некоторые молочно-кислые бактерии способны синтезировать антибиотики и с их помощью подавлять развитие болезнетворных микробов.
Препараты, содержащие бактерии (эубиотики или пробиотики ): колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол, микрококкобактерин, линекс, бактисубтил и другие.
Препараты, содержащие бактериофаги: бактериофаг брюшнотифозный, бактериофаг дизентерийный, бактериофаг сальмонеллезный, бактериофаг коли-протейный, бактериофаг стафилококковый, бактериофаг стрептококковый, бактериофаг пиоцианеус, бактериофаг синегнойный, бактериофаг клебсиеллезный, пиофаг комбинированный и другие.

Температура является наиболее значительным фактором, оказывающим влияние на жизнедеятельность микробов. Температура, необходимая для роста и размножения бактерий одного и того же вида, варьирует в широких пределах. Различают температурный оптимум, минимум и максимум.

Температурный оптимум соответствует физиологической норме данного вида микробов, при которой размножение происходит быстро и интенсивно. Для большинства патогенных и условно-патогенных микробов температурный оптимум соответствует 37°С.

Температурный минимум соответствует температуре, при которой данный вид микроба не проявляет жизнедеятельность.

Температурный максимум - температура, при которой рост и размножение микробов прекращается, все процессы метаболизма снижаются и может наступить гибель.

В зависимости от температуры, оптимальной для жизнедеятельности, различают 3 группы микроорганизмов: 1)психрофильные, холодолюбивые, размножающиеся при температуре ниже 20°С (иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонады, вызывающие заболевания человека. Размножаясь в пищевых продуктах, они более вирулентны при низких температурах); 2)термофильные, оптимум развития которых лежит в пределах 55°С (в организме теплокровных не размножаются и медицинского значения не имеют); 3)мезофильные, активно размножаются при температуре 20 -40°С, оптимум температуры развития для них 37°С (патогенные для человека бактерии).

Микроорганизмы хорошо выдерживают низкие температуры. На этом основано длительное сохранение бактерий в замороженном состоянии. Однако ниже температурного минимума проявляется повреждающее действие низких температур, обусловленное разрывом клеточной мембраны кристаллами льда и приостановкой метаболических процессов.

Низкая температура приостанавливает гнилостные и бродильные процессы. Это лежит в основе консервации субстратов (в частности, пищевых продуктов) холодом. Губительное действие высокой температуры (выше температурного максимума для каждой группы) используется при стерилизации.Стерилизация - обеспложивание - это процесс умерщвления на изделиях или в изделиях или удаление из объекта микроорганизмов всех видов, находящихся на всех стадиях развития, включая споры (термические и химические методы и средства). Для гибели вегетативных форм бактерий достаточно действия температуры 60°С в течение 20-30 мин; споры погибают при 170°С или при температуре 120°С пара под давлением (в автоклаве).

Асептика - условия и комплекс мероприятий, направленных против возможности попадания микроорганизмов в рану, ткани, органы, полости тела больного при хирургических операциях, перевязках, инструментальных исследованиях, а также на предотвращение микробного и другого загрязнения при получении стерильной продукции на всех этапах технологического процесса.

Рост и размножение микробов происходит при наличии воды, необходимой для пассивного и активного транспорта питательных веществ в цитоплазму клетки. Снижение влажности (высушивание) приводит к переходу клетки в стадию покоя, а затем к гибели. Наименее устойчивыми к высушиванию являются патогенные микроорганизмы - менингококки, гонококки, трепонемы, бактерии коклюша, ортомиксо-, парамиксо- и герпес-вирусы. Микобактерии туберкулеза, вирус натуральной оспы, сальмонеллы, актиномицеты, грибы устойчивы к высушиванию. Особой устойчивостью к высушиванию обладают споры бактерий. Устойчивость к высушиванию повышается, если микробы предварительно замораживают. Для сохранения жизнеспособности и стабильности свойств микроорганизмов в производственных целях используется метод лиофильной сушки - высушивание из замороженного состояния под глубоким вакуумом.

В процессе лиофилизации производят: 1) предварительное замораживание материала при t -40 - -45°С в спиртовых ваннах в течение30-40мин; 2) осуществляют сушку из замороженного состояния в вакууме в сублимационных аппаратах в течение 24 - 28 часов.

Процесс высушивания имеет 2 фазы: сублимация льда при t ниже 0°С и десорбция - удаление части свободной и связанной воды при t выше 0°С.

Лиофилизацию используют для получения сухих препаратов, когда не происходит денатурации белков и не изменяется структура материала антисыворотки, вакцины, сухая бактериальная масса). В лабораторных условиях лиофилизированные культуры микробов сохраняются в течение 10-20 лет, причем культура остается чистой и не подвергается мутациям.

Действие лучистой энергии на микроорганизмы. Солнечный свет,особенно его ультрафиолетовый и инфракрасный спектры, губительно действуют на вегетативные формы микробов в течение нескольких минут.

Инфракрасное излучение используется для стерилизации объектов, которая достигается за счет теплового воздействия температурой 300°С в течение 30 мин. Инфракрасные лучи оказывают воздействие на свободнорадикальные процессы, в результате чего нарушаются химические связи в молекулах микробной клетки.

Для дезинфекции воздуха помещений лечебно-профилактических учреждений и аптек широко используются ртутно-кварцевые и ртутно-увиолевые лампы, являющиеся источником ультрафиолетовых лучей. При действии УФЛ с длиной волны 254 нм в дозе 1,5-5 мк Вт т/с на 1 см 2 при 30-ти минутной экспозиции погибают все вегетативные формы бактерий. Повреждающее действие УФ излучения вызвано повреждением ДНК микробных клеток, приводящим к мутациям и гибели.

Ионизирующая радиация обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном микробов действием. Для стерилизации инструментов одноразового использования (игл, шприцев) используют гамма-излучение, источником которого являются радиоактивные изотопы 60 Со и 137 Сз в дозе 1,5-2 МN.рад. Этим методом стерилизуют также системы переливания крови и шовный материал. Действие ультразвука в опреде­ленных частотах на микроорганизмы вызывает деполимеризацию органелл клетки, денатурацию входящих в их состав молекул в результате локального нагревания или повышения давления. Стерилизация объектов ультразвуком осуществляется на промышленных предприятиях, так как источником УЗ являются мощные генераторы. Стерилизации подвергаются жидкие среды, в которых убиваются не только вегетативные формы, но и споры.

Пастеризация - стерилизация при 65-70°С в течение 1 часа для уничтожения бесспоровых микроорганизмов (молоко освобождается от бруцелл, микобактерий туберкулеза, шигелл, сальмонелл, стафилококков). Хранят на холоде.

Тиндализация -дробная стерилизация материалов при 56-58°С в течение 1 часа 5-6 дней подряд. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.).

Стерилизация фильтрованием - освобождение от микробов материала, который не может быть подвергнут нагреванию (сыворотка крови, ряд лекарств). Используются фильтры с очень мелкими порами, не пропускающими микробы: из фарфора (фильтр Шамберлана), каолина, асбестовых пластинок (фильтр Зейтца). Фильтрование происходит под повышенным давлением, жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник или создается разрежение воздуха в приемнике и жидкость всасывается в него через фильтр. К фильтрующему прибору присоединяется нагнетаю­щий или разрежающий насос. Прибор стерилизуют в автоклаве.

Стерилизацию сухим жаром осуществляют в сухожаровых шкафах (печь Пастера). Сухим жаром стерилизуют лабораторную посуду Режим стерилизации: 160°С - 60 мин, 180°С -15 мин, 200°С - 5 мин. Жидкости, питательные среды, предметы из резины и синтетических материалов нельзя стерилизовать сухим жаром.

Стерилизации паром

Существует 2 режима стерилизации.

1. Стерилизация текучим паром в автоклаве или аппарате Коха при незавинченной крышке и открытом выпускном кране, когда антибактериальное действие пара проявляется в отношении вегетативных форм. Так стерилизуют среды с витаминами и углеводами, мочевиной, молоком, картофелем и желатиной. Для полного обеспложивания применяют дробную стерилизацию (при 100°С) 20-30 мин 3 дня.

2. Стерилизация паром под давлением в автоклаве - наиболее эффективный метод обеспложивания. При однократной обработке при 1-2 атм в течение 15-25 мин. погибают как вегетативные, так и споровые формы бактерий. Этим методом стерилизуют перевязочный материал, операционное белье, хирургические инструменты, лабораторную посуду, инфицированный материал, инъекционные растворы. Материал помещают в емкости (биксы). На дно бикса помещают прокладки из ткани, впитывающие влагу после стерилизации. Стерильность материала сохраняется 3 суток.

Паром под давлением стерилизуют также и питательные среды, кроме сред, содержащих нативные белки, жидкости, приборы, имеющие резиновые части. Простые среды (МПА, МПБ) стерилизуют 20 мин при 120°С (1 атм). Среды, содержащие нативные белки и углеводы, при этой температуре нельзя стерилизовать, т. к. это легко изменяющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100°С или при 112°С (0,5 атм) 10-15 мин. Различные жидкости, приборы, имеющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют при 120°С(1 атм) в течение 20 мин.

Контроль стерилизации

Для контроля используют различные тесты, представляющие чаще всего порошкообразные вещества, меняющие консистенцию или цвет при достижении определенной температуры стерилизуемого материала (бензойная кислота 121°С, антипирин - 113°С, резорцин - 110°С). В настоящее время используются бумажные индикаторы стерилизации одноразового применения для контроля параметров режимов работы паровых и воз­душных стерилизаторов. Бумажные полоски закладываются в разных местах со стерилизуемым материалом и после окончания цикла сверяют изменение окраски индикатора с эталоном. Если индикатор светлее эта­лона, стерилизуемые объекты подлежат повторной стерилизации.

Для экспресс-контроля концентраций рабочих растворов для дезинфекции также используются индикаторные полоски (Дезаконт-ПВ-01).

Цели занятия:

1. Изучить сущность дыхания бактерий, классифицировать микробы по типу дыхания.

2. Освоить методику посевов и выделения чистых культур аэробов и анаэробов.

3. Изучить характер влияния на микроорганизмы физических и хими­ческих факторов.

4. Освоить методы стерилизации и принцип работы автоклава и сухо-жаровогр шкафа.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Сущность дыхания бактерий. Классификациямикробов по типу дыхания.

2. Аэробный и анаэробный типы биологического окисления.

3. Принципы культивирования анаэробных бактерий.

4. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация.

5. Действие на микроорганизмы физических и химическихфакторов.Стерилизация и дезинфекция. Асептика и антисептика.

Уметь:

1. Готовить посуду к стерилизации в сухожаровом шкафу и автоклаве.

2. Описать культуральные свойства бактерий.

3. Освоить методику создания анаэробных условий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Просматривая извлеченные из термостата чашки с пластинчатым агаром, засеянные в первый день исследования, обращают внимание на наличие колоний разных типов по форме, цвету величине, консистенции. Каждому виду микроба свойственен определенный характер колоний.Этопомогает выбрать колонию искомого микроба и поставить диагноз заболевания. Снимают изолированную колонию петлей и пересевают на скошенный агар, а из остатка пересеянной колонии готовят микропрепарат и исследуют его, окрасив по Граму После инкубации посева в термостатена скошенном агаре вырастает чистая культура микроба.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Бригада студентов учитывает пересевы бактериальных культур.

2. Каждый студент изучает и подробно описывает различные типы колоний, выросшие на чашках. Отсевает одну из колоний на скошенный агар, а из остатка бактерий на петле делает мазок, окрашиваетпо Граму и микроскопирует. Результаты записывают в протокол.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Колонии на пластинчатом агаре в чашках Петри. Отсев одной колонии на скошенный агар.

2. Рассмотрение различных методов культивирования анаэробов: анаэростат, посев по Фортнеру посев на среду Китт-Тароцци, столбик среды Вильсона-Блера, использование газ-пакета.

3. Демонстрация аппаратуры для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, электрический стерилизатор, фарфоровые свечи и фильтры Зейтца. Термостат и терморегуляторы, свертыватель Коха. Тесты контроля стерилизации.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что называется стерилизацией?

2. Что такое дезинфекция?

3. Что такое асептика и антисептика? "

4. Что такое пастеризация?

5. Каковы условия стерилизации в автоклаве?

6. Каковы условия стерилизации в сухожаровых печах Пастера?

7. Какие тесты контроля стерилизации вы знаете?

8. Что такое дробная стерилизация и в каких случаях к ней прибегают?

9. Почему в отдельных случаях при пересеве одной колонии получаем рост смеси бактерий?

10. Какие свойства необходимо учитывать при изучении колоний?

11. Как характеризуется рост бактерий на жидких и полужидких

питательных средах?

12. В чем сущность аэробного типа окисления?

13. В чем сущность анаэробного типа окисления?

14. Какие среды применяют для культивирования анаэробов?

15. Какие существуют методы культивирования анаэробов?

16. Какой способ чаще всего применяется для стерилизациистеклянной лабораторной посуды?

17. Как стерилизуются дифференциально-диагностические среды, содержащие углеводы?

18. Как стерилизуют сывороточные питательные среды?

19. Как стерилизуют Простые питательные среды?

20. Какие существуют методы выращивания облигатных анаэробов?

21. Какие бактерии называют микроаэрофилами?

22. Какие бактерии называют психрофилами, мезофилами, термофилами?

ЗАНЯТИЕ №7

Темы:

Методы выделения и идентификация чистых культур аэробных бактерий (продолжение): биохимическая активность бактерий.

Антибиотики.

План занятия:

1. Идентификация выделеннойчистой культуры по биохимическимсвойствам.

2. Антагонизм микроорганизмов.

3. Классификации антибиотиков.

4. Механизмы антимикробного действия важнейших групп антибиотиков.

5. Методы определения антибиотиков в жидкостях организма.

6. Количественное и качественное определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

7. Механизмы развития антибиотикорезистентностибактерий и пути еепреодоления.

8. Осложнения при лечении антибиотиками.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

А . Идентификация выделенной на скошенном агаре культуры бактерий проводится после установления чистоты (однородности) культуры по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам. Определяют ферментативные (биохимические) свойства микробов, фаго - и колициночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую принадлежность. В некоторых случаях у выделенных бактерий определяют также эпидемиологические маркеры (серовар, фаготип, биовар, колициновар), с помощью которых можно установить очаги инфекции и пути ее распространения.

Симбиоз - взаимоотношения микроорганизмов, при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичный пример таких взаимоотношений - совместное развитие аэробных и анаэробных бактерий. В кефирных зернах одновременно развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи, при этом молочнокислые бактерии, испытывающие потребность в витаминах, получают их в результате развития дрожжей, последние получают благоприятные условия для развития за счет подкисления среды. Приметабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве питательного материала. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена, например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clostridium в ассоциации с различными аэробными бактериями, главным образом стафилококками и стрептококками.

Разновидностью метабиоза являетсясателлитизм, для которого характерно, что одни микроорганизмы выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого микроорганизма или макроорганизма - хозяина, как например нормальная микрофлора у человека. Присинергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения продуктов, стимулирующих их развитие.

Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е между ними при их развитии наблюдаетсяантагонизм. Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны:

1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее.

2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Вначале они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий.

3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую средуантибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.).

Процессхищничества состоит в том, что некоторые микроорганизмы разрушают клетки других видов микроорганизмов и используют их в качестве питательного субстрата. К числу микроорганизмов-хищников относят главным образом миксоформы (миксобактерии, миксомицеты).

Наиболее существенной формой конкурентных взаимоотношений, имеющей важное практическое использование, является образование микробами-продуцентами специфических продуктов обмена, угнетающих или полностью подавляющих развитие микроорганизмов других видов.

Практическое значение антагонизма для медицины: 1) применение бактериальных препаратов, содержащих живые антагонистически действующие микроорганизмы, для угнетения патогенных и условно-патогенных микробов и лечения нарушений нормального микробиоценоза кишечника (дисбактериоза) - колибактерин, бифидумбактерин, лактобактерин и др.; 2) использование микробов-антагонистов для производства антибиотиков.

Антибиотики - вещества, образуемые различными живыми клеточными структурами, способные подавлять рост и вызывать гибель определенных микроорганизмов. По происхождению антибиотики подразделяют на следующие группы:

Антибиотики, образуемые бактериями (грамицидин, полимиксин и др.);

Антибиотики, образуемые актиномицетами (линкомицин и др.);

Антибиотики, образуемые грибами (пенициллин, цефалоспорины и др.);

Антибиотики, образуемые растениями (фитонциды: аллицин, рафанинидр.);

Антибиотики, образуемые животными клетками (экмолин, эритрин);

Синтетические и полусинтетические антибиотики.

По химическому составу антибиотики относятся к следующим основным группам:

Ароматические соединения (левомецитин);

Тетрациклины, содержащие четыре конденсированных шестичленных цикла (тетрациклины и др.);

Аминогликозидные соединения, в составе которых имеются аминосахара (стрептомицин и др.);

Макролиды: содержат макроциклическоекольцо, связанное с аминосахарами (эритромицин и др.);

Ациклические (полиеновые) соединения с несколькими двойными связями - /СН=СН/ (нистатин и др.);

(Фтор) хинолоны.

По антимикробному спектру антибиотики подразделяют на две группы: узкого и широкого спектра действия. Антибиотики узкого спектра действуют на определенные группы бактерий (например, пенициллин, оказывающий губительное действие только на шаровидные бактерии, спирохеты и некоторые грамположительные бактерии). Антибиотиками широкого спектра действия являются аминогликозиды, подавляющие рост кислотоустойчивых, многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, риккетсий, хламидий.

Антибактериальное действие антибиотиков измеряют в единицах действия (Е.Д.), содержащихся в 1 мл раствора препарата или в 1 мг химически чистого вещества. За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях.

Механизм антибактериального действия антибиотиков различен. У одних он связан с нарушением или блокированием синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины). У других - с адсорбцией на ЦПМ и взаимодействием с ее стерольным компонентом, что приводит к быстрой потере клеткой низкомолекулярных водорастворимых веществ цитоплазмы или нарушением жизненно важных функций ЦПМ (нистатин, полимиксины). У третьих - в блокировании синтеза белка рибосомами бактерий и нарушении считывания генетического кода, что нарушает репликацию бактерий (стрептомицин). Антибиотики, обладающие противоопухолевым действием, избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках злокачественных опухолей, для которых характерен дефект репарационных механизмов, в связи с чем они не в состоянии восстанавливать поврежденную ДНК.

Цели занятия:

1. Изучить сущность и механизм действия различных ферментных систем у бактерий; освоить методику их изучения и применения для идентификации чистых культур.

2. Изучить особенности взаимоотношений между микроорганизмами как основу учения об антибиотизме и антибиотиках.

3. Освоить методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Классификация ферментов бактерий, механизмы их действия, методы изучения.

2. Этапы выделения чистых культур микроорганизмов, их идентификация по биохимическим свойствам.

3. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Принципы атимикробной химиотерапии.

4. Симбиотические и конкурентные взаимоотношения между микроорганизмами.

5. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы - продуценты антибиотиков.

6. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения.

7. Методы определения антибиотикочувствительности бактерий.

8. Побочное действие антибиотиков на организм человека.

Уметь:

1. Интерпретировать результаты изучения ферментативной активности бактерий и их антибиотикограммы.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Устойчивость ферментных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими признаками для идентификации бактерий и установления микробиологического диагноза. Для определения биохимических свойств исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические среды, которые в зависимости от состава и своего на­значения можно разделить на 4 группы:

Среды с сахарами или многоатомными спиртами для определения сахаролитической активности;

Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием

окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами;

В состав дифференциально-диагностической среды обычно входит индикатор, указывающий на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.

Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. При ферментации бактериями углеводов с образованием кислоты и альдегидов цвет среды меняется за счет находящегося в ней индикатора, что создает впечатление пестроты - «пестрый ряд». В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крахмал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты /С02, H2, СН4/, последние накапливаются в «поплавке».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находящийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кислота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя (цвет среды не изме­няется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Среда Вильсона-Блера. Готовят из мясо-петонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na2SO3, хлористое железо FeCl2. На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. При этом в анаэробных условиях осуществляется восстановление сернокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой и пептоном. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, при­чем различные виды микробов дают характерную для него форму разжижения (послойно в виде гвоздя, елочки и т.д.). При посеве на свер­нутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение). В молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет.

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Индикаторную бумажку помещают между стенкой пробирки с МПА и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) дает образование красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой. При взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещенной между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды-желтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора в красный.

Определение образования ацетона проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола дает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата в целях выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитратпермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой.

Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий. Бумажки пропитаны индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. веществами. Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изме­нению цвета индикатора. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Посев испытуемой культуры производится в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6).

Наличие каталазы у аэробов и факультативных анаэробов выявляется внесением петли культуры бактерий в каплю 3% перекиси водорода. При этом выделяются пузырьки O2. У облигатных анаэробов каталаза отсутствует, и перекись водорода оказывает на них губительное действие.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. Бумажка синеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют иодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, дает синее окрашивание среды. Тип окисления глюкозы в аэробных или анаэробных условиях устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый си­ний. Для создания анаэробных условий среда заливается слоем вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зеленый цвет среды в желтый. Утилизация глюкозы в аэробных и анаэробных условиях свидетельствует о преобладании бродильных процессов. Аэробы (Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, анаэробы - только в анаэробных. Факультативные анаэробы (Escherichia coli) утилизирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Гемолитические свойства микроорганизмов изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона.

Главная » Транскрипции » Физические факторы действующие на микроорганизмы. Влияние физических, химических и биологических факторов на микроорганизмы